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精液冷冻对人工授精技术和畜牧业发展有明显促进作用,近年来越来越受到广大畜牧从业人员的高度重视。在反刍兽中,牛的冻精技术相对成熟,却一直没有打破羊冻精技术的瓶颈。为了提高羊的冻精质量,本研究筛选出了七种基础稀释液,探讨不同的基础冻精稀释液对湖羊冷冻精液活力的影响,从而选择出最佳的冻精基础稀释液配方;通过摸索解冻温度和实践,明确了最佳解冻方式,为提高湖羊精冻精品质奠定基础。在此基础上,分别于基础稀释液中添加不同浓度的原花青素(OPC)或线粒体靶向抗氧化剂Mitoquinone(MitoQ),探究其对湖羊冻精抗氧化能力的影响及其保护作用,为其在湖羊冻精种的合理利用提供试验依据。本研究结果如下:1、为优化湖羊冻精生产工艺,提高冻精质量,本研究以湖羊种公羊的精液为试验材料,分别选择7种稀释液进行处理,采用0.25 mL细管和液氮熏蒸法进行冷冻,并设置不同解冻温度和时间进行交叉试验。结果表明:7号稀释液处理的湖羊精子在42℃和70℃两种解冻条件下基础物理指标均最高;两种解冻温度下,42℃解冻17 s和70℃解冻5 s的解冻效率最佳,其中70℃解冻5 s的解冻效率高于其他各组,其活率、活力、质膜完整性和顶体完整率分别达50.62%、43.09%、40.09%和54.37%。综上所述,7号稀释液和70℃/5 s是湖羊精液冷冻的最佳稀释液和解冻条件。2、在湖羊冻精基础稀释液中分别添加原花青素(PC),使其最终浓度为0、10、20、40、60μg/mL,经冷冻解冻后分别进行基础物理指标检测,并进行一系列抗氧化指标检测,探讨原花青素对湖羊精液冷冻效果的影响。结果表明:当PC添加的质量浓度为10μg/mL时,解冻后精子的活率、活力、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性最高,分别达58.91%、56.03%、50.03%、53.42%和50.19%,其中活力和质膜完整性显著高于未添加组。10μg/mL PC添加组解冻后精子的SOD值和GSH-PX值分别为212.60 U/mL和125.04 U/L,均显著高于未添加组;ROS和MDA值为363.05 U/ml和7.02 nmol/L,显著低于未添加组;NO和NOS值为8.22μmol/L和35.90μmol/L,其中NOS值显著低于对照组(P﹤0.05)。添加40μg/mL的PC时,精子解冻后质量显著下降,对精子表现为促氧化损伤。在湖羊精液冷冻中,添加10μg/mL的PC可降低精子氧化损伤,提高冻精品质,当PC质量浓度提高至40μg/mL时表现为对精子的毒副作用。3、选择身体健康的成年种公羊精液等分成6份。在稀释液中添加不同浓度的MitoQ,其中M0为对照组,未添加MitoQ。其余各组浓度分别为M1:50 nmol/L,M2:100 nmol/L,M3:150 nmol/L,M4:2 00μmol/L及M5:400μmol/L。精子经冷冻解冻过程后检测精子活率及精子活力。对精子结构完整性的检测包括质膜和顶体的完整率。抗氧化检测指标包括SOD、ROS、GSH-PX、MDA等。线粒体检测指标为线粒体活性。结果表明:当MitoQ添加的浓度为150 nmol/L(M3)时,其解冻后精子的活率、活力、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性最高,分别达55.00%、52.34%、48.32%、54.51%和51.28%,其中线粒体活性显著高于M2组。M3组解冻后精子的SOD值和GSH-PX值分别为203.90U/mL和123.62 U/L,两者均显著高于M0组;M3组解冻后精子的ROS和MDA值分别为298.34 U/ml和4.99 nmol/L,显著低于M0组。当MitoQ的添加浓度提高至200 nmol/L(M4)和400 nmol/L(M5)时,冻精质量开始下降,并表现为对精子的氧化损伤。在湖羊精液冷冻中,添加150 nmol/L的MitoQ可降低精子氧化损伤,冻精质量得到提升。当MitoQ的添加浓度超过200 nmol/L时对保护精子没有作用。综上,在湖羊冻精基础稀释液中分别添加PC和MitoQ,能有效提高解冻后精子品质。