目的:糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症之一,如不积极治疗将有10%发展至终末期肾衰竭。目前,糖尿病肾病的治疗仅限于控制血糖、血压和蛋白尿等,尚缺乏理想的防治方法,因此寻找糖尿病肾病的理想防治靶点是当今肾脏病研究的热点之一。研究表明一系列与生长发育相关的因子在糖尿病肾病发病中重新活跃,呈现高表达,并与肾脏的病理改变程度密切相关,推测可能参与糖尿病肾病的病理生理过程,并有可能成为糖尿病肾病防治的新靶点。本试验拟以发育相关因子Gremlin作为靶点,STZ诱导糖尿病小鼠模型,观察转染gremlin siRNA质粒对糖尿病小鼠肾脏病理学变化、肾脏细胞增殖凋亡情况、肾功能及BMP7表达等的影响,探讨抑制Gremlin表达后对肾脏的可能保护作用。同时,高糖刺激体外培养的小鼠系膜细胞,观察转染gremlin siRNA质粒对细胞增殖、细胞外基质的分泌以及细胞内Gremlin、BMP7、TGF-β、MMP2和磷酸化Smad5等因子表达的影响,揭示Gremlin表达抑制后对肾脏保护作用的可能机制。方法:动物实验部分:选择12周龄健康的雄性CD1小鼠54只,随机分为3组,正常对照组(N)、糖尿病转染空质粒组(STZ)、糖尿病转染gremlin siRNA质粒组(Gremlin-si)(每组18只)。水合氯醛腹腔注射麻醉下行单肾切除术,术后两周STZ及Gremlin-si组小鼠腹腔单次注射链脲佐菌素(STZ)150mg/kg,对照组只注射相同体积的枸橼酸盐缓冲液,72h后确定是否成模。成模当天Gremlin-si组小鼠尾静脉快速注射gremlin siRNA质粒和要求剂量的转染载体,STZ组用同样方法注射对照质粒,此后每隔7天注射一次。分别于成模后1周、2周及12周每组取6只小鼠处死,收集小鼠24小时尿液和血标本,测尿蛋白、肌酐,血糖、血肌酐;取部分肾组织置于4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,同时制备2-4μm厚切片,光镜HE、PAS染色观察肾脏病理改变,免疫组化观察Gremlin、PCNA和IV型胶原的表达,同时应用免疫双染技术观察PCNA和Gremlin的表达及Gremlin与细胞增殖的关系,TUNEL凋亡检测试剂盒检测晚期糖尿病小鼠肾脏细胞凋亡情况,Western blotting检测Gremlin、BMP7的表达。细胞实验部分:将小鼠系膜细胞(MMCs)分成4组:正常糖组(NG);高糖刺激组(HG);高糖刺激转空质粒组(HG+V)和高糖刺激转gremlin siRNA质粒组(gremlin-si)。细胞培养至80%融合时传代至6孔板和8孔腔室玻片,用不含有抗生素的DMEM培养基培养24小时,改用不含胎牛血清的DMEM培养基同步化12小时,然后用Lipofectmin 2000将gremlin siRNA质粒和空质粒转染至对应组。培养24小时后,HG、HG+V和gremlin-si组用高糖培养基(含葡萄糖30mmol/L)培养,NG组用含葡萄糖5.5mmol/L培养基培养,分别于高糖刺激后6h、12h、24h和48h收集细胞,检测培养基内IV型胶原表达;细胞免疫组化检测Gremlin和PCNA表达,观察细胞增殖情况;免疫共沉淀验证Gremlin与BMP7的相互作用;Western blot检测Gremlin、BMP7、TGF-β、MMP2及磷酸化Smad5等的表达情况。结果应用图像分析系统进行定量分析,所有数据用均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行统计,组间比较采用多重比较的方差分析,p<0.05有统计学意义。结果:动物实验部分:转染gremlin siRNA质粒有效抑制了Gremlin在糖尿病小鼠肾脏的表达。转染gremlin siRNA质粒后肾小球和肾小管的直径均较STZ组减小,并接近正常水平,STZ组和gremlin-si组差异有统计学意义。免疫双染结果显示Gremlin与PCNA同时强表达于同一细胞,说明Gremlin和细胞增殖有一定关系。免疫组化PCNA染色显示,STZ组细胞增殖明显高于N组,给予gremlin siRNA质粒后,PCNA染色明显减少,说明抑制Gremlin表达可以抑制糖尿病早期肾脏细胞的增殖。TUNEL同样显示给予gremlin siRNA质粒后,显著地抑制了晚期糖尿病小鼠肾脏细胞凋亡。STZ组BMP7表达在第1和第2周轻度增高,而在第12周显著下降,转染gremlin siRNA质粒后使BMP7的表达接近N组,且STZ组和gremlin-si组差异显著。细胞实验部分:Gremlin蛋白在HG组和HG+V组各时间点表达均强于N组, HG+gremlin-si组较HG+V组Gremlin表达受到抑制,各组间差异有统计学意义。免疫细胞化学结果显示:HG组和HG+V组PCNA阳性细胞较N组明显增多,而转染gremlin siRNA质粒后,HG+gremlin-si组较HG+V组PCNA阳性细胞有所减少(p<0.05),说明转染gremlin siRNA质粒抑制了高糖刺激小鼠系膜细胞的增殖。细胞培养基内IV型胶原的分泌水平在转染gremlin siRNA质粒后明显下降,并且HG+gremlin-si组较HG+V组MMP2的表达回升,IV型胶原的分泌水平在转染后下降可能与MMP2表达回升使细胞外基质降解有关。免疫共沉淀结果显示BMP7与Gremlin存在相互作用,同时我们观察到高糖刺激的小鼠系膜细胞Gremlin表达在6-48h持续升高;BMP7在高糖刺激早期6h和12h表达轻度增高,24h以后表达显著下降;磷酸化smad5在高糖刺激24h以后也明显下降。转染gremlin siRNA质粒后,即HG+gremlin-si组较HG+V组48h Gremlin表达受到抑制,而BMP7和磷酸化smad5表达恢复,且两组间差异有统计学意义(p<0.05)。TGF-β在HG组和HG+V组均表达强于N组,而转染抑制了TGF-β在高糖刺激小鼠系膜细胞内的表达。结论:转染Gremlin si-RNA质粒能够有效抑制糖尿病小鼠模型肾脏组织Gremlin的表达,抑制Gremlin表达后无论是肾脏早期增生、肥大、细胞增殖还是晚期肾脏细胞凋亡、肾脏纤维化及肾功能恶化都得到改善,抑制Gremlin表达后出现这些作用可能是通过使BMP7的表达及活性恢复而实现的,因此,抑制Gremlin表达可起到防治糖尿病肾病的作用,Gremlin是糖尿病肾病防治的新靶点。