目的：　　目前，胃癌发病率在全球各类肿瘤中居第四位，且其病死率居于第二位。尽管综合治疗能够改善患者生存，晚期胃癌患者仍然预后不良。表皮生长因子受体(EGFR)过表达与胃癌预后不良显著相关，然而面对全人群的抗EGFR单克隆抗体治疗Ⅲ期临床研究均以失败告终。因此，探究胃癌抗EGFR治疗的耐药机制显得尤为重要。RAS突变是结肠癌中抗EGFR单抗治疗的重要疗效预测因子。然而，胃癌患者RAS突变率仅有约5％。因此，探索RAS突变之外的胃癌抗EGFR单抗的耐药因素具有重要意义。　　抗EGFR单抗耐药的重要机制之一是EGFR替代通路的异常活化，如c-Met及IGF-R，这些替代通路具有与EGFR共同的下游通路。核因子κB受体活化因子配体(RANKL)能够在破骨细胞分化过程中诱导EGFR活化。RANKL是肿瘤坏死因子家族的成员之一，其受体核因子κB受体活化因子受体(RANK)参与破骨细胞分化成熟。已有研究在乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌等多种实体肿瘤中证实了RANK的表达。近期研究证实，RANKL/RANK通路能够通过激活AKT及ERK通路促进肿瘤细胞迁移。另外，在骨转移模型中，抑制RANKL的作用能够增加抗EGFR单抗帕尼单抗的敏感性。因此我们猜测，RANKL/RANK通路可能在调控肿瘤细胞EGFR活性中起重要作用，进而影响肿瘤细胞对西妥昔单抗的敏感性。　　本研究中，我们探讨了胃癌患者中RANKL与EGFR表达的相关性，以及RANKL/RANK通路对胃癌细胞中EGFR通路及西妥昔单抗敏感性的影响。本研究结果为胃癌抗EGFR治疗提供一个新的机制。　　材料与方法：　　1、采用MTT法测定细胞活力。　　2、采用集落形成实验观察细胞增殖能力。　　3、采用Western blot检测RANK，RANKL，EGFR，p-EGFR，AKT,p-AKT,ERK，p-ERK，c-Src，p-c-Src和actin蛋白的表达。　　4、采用免疫共沉降技术检测蛋白间的共结合。　　5、采用Lipofectamine2000试剂进行瞬时转染。　　6、采用免疫组化染色检测胃癌组织标本中RANKL、RANK及EGFR的表达情况。　　7、统计学处理：每次实验重复3次，数据以均值士标准差（(x)±s）表示。采用SPSS21.0统计软件进行进行t检验、Spearman秩相关检验和卡方检验，P＜0.05有统计学意义。　　结果：　　1、胃癌患者中，RANKL表达与EGFR表达正相关　　我们选择了68例原发性胃腺癌患者组织标本，采用免疫组化方法检测RANKL、RANK与EGFR的表达情况。　　结果显示，25例(37％)患者RANKL呈高表达，33例(48％)的患者RANK呈高表达，19例(28％)患者EGFR呈高表达。Spearman相关分析表明RANKL表达与RANK的表达呈显著正相关(p=0.014，r=0.297)，并与EGFR的表达呈正相关(p=0.004，r=0.341)。综上，我们的结果表明RANKL与EGFR的表达在胃癌标本中呈正相关，提示了胃癌中RANKL/RANK通路与EGFR信号通路之间具有一定的相关性。　　2、RANKL能够诱导胃癌细胞EGFR及其下游通路活化　　已有研究证实，EGFR参与RANKL介导的破骨细胞分化。另有研究证实，RANKL能够在破骨细胞分化过程中诱导EGFR活化。因此，我们探索了RANKL在胃癌细胞中对EGFR通路的作用。我们选择了RAS野生型的胃癌SGC-7901细胞系和MGC-803细胞系。这两种细胞系经RANKL作用后，均在短时间点观察到了EGFR、AKT、ERK以及c-Src的一过性活化。为了观察RANKL对胃癌细胞增殖作用的影响，我们用不同浓度的RANKL分别作用SGC-7901及MGC-803细胞48小时。SGC-7901细胞中，0.1μg/ml RANKL作用后细胞增殖率为100.1％±2.9％，1μg/ml RANKL作用后细胞增殖率为103.8％±0.7％。MGC-803细胞中，0.1μg/mlRANKL作用后细胞增殖率为99.9％±1.2％，1μg/ml RANKL作用后细胞增殖率为102.9％±0.2％。研究结果表明，无论RANKL作用浓度在0.1μg/ml或1μg/ml，均对胃癌细胞的增殖作用无明显影响。　　3、RANKL抑制胃癌细胞对西妥昔单抗的敏感性　　由于RANKL能够激活EGFR通路，我们猜测RANKL/RANK通路同样能够调控西妥昔单抗的敏感性。为了检测RANKL/RANK通路对西妥昔单抗敏感性的影响，我们联合应用西妥昔单抗与RANKL作用于胃癌SGC-7901及MGC-803细胞。与单独应用西妥昔单抗相比，联合应用RANKL显著降低了西妥昔单抗对胃癌细胞增殖的抑制作用（SGC-7901细胞中p=0.009;MGC-803细胞中p=0.0007）。另外，我们在集落形成实验中也证实了联合应用RANKL降低西妥昔单抗对胃癌细胞单克隆形成能力的抑制作用。我们同时在信号水平探索了RANKL对西妥昔单抗的影响。在胃癌SGC-7901细胞中，应用西妥昔单抗降低了EGFR、AKT及ERK的磷酸化水平，而联合应用RANKL逆转了西妥昔单抗对EGFR通路活性的抑制作用。　　结果证实，RANKL通过激活EGFR及其下游信号通路降低胃癌细胞对西妥昔单抗的敏感性。　　4、阻断RANKL/RANK通路能够逆转RANKL诱导的胃癌细胞西妥昔单抗耐药　　为进一步探讨RANKL/RANK通路在胃癌西妥昔单抗敏感性中的作用，我们在SGC-7901细胞中瞬时敲除RANK后，联合应用西妥昔单抗及RANKL。MTT检测结果显示敲除RANK后胃癌细胞抑制率为21.0％±5.9％。此外，对照组单独应用西妥昔单抗的抑制率高于联合应用RANKL(p=0.04)，而在敲除RANK组两者无明显差距(p=0.348)。因此，敲除RANK逆转了RANKL诱导的胃癌SGC-7901细胞对西妥昔单抗耐药的发生。接下来，我们应用骨保护素(OPG)抑制RANKL与RANK结合。同样地，对照组单独应用西妥昔单抗的抑制率高于联合应用RANKL(p=0.007)，而OPG组二者无明显差距(p=0.319)。　　结果表明，敲除RANK与应用RANKL抑制剂均能增强西妥昔单抗对SGC-7901的抑制作用。我们同时验证了应用si-RNA下调RANK表达及应用OPG抑制RANKL作用后EGFR信号通路的变化。与对照组相比，敲除RANK后EGFR及其下游通路AKT、ERK的磷酸化水平下降。另外，对照组中联合应用RANKL后逆转了西妥昔单抗对EGFR通路的抑制作用，而敲除RANK抑制了这种逆转作用。同样的，应用OPG也能抑制RANKL对西妥昔单抗的逆转作用。这些结果表明，抑制RANKL/RANK通路通过下调EGFR及其下游AKT、ERK通路磷酸化逆转了RANKL对西妥昔单抗敏感性的抑制作用。　　5、RANKL诱导的c-Src活化参与胃癌细胞对西妥昔单抗耐药　　本研究证实了RANKL能够激活c-Src，且既往研究证实c-Src是EGFR与其他酪氨酸激酶串话的关键中间因子。我们猜测，c-Src可能作为RANKL/RANK通路与EGFR通路的中间因子参与胃癌细胞对西妥昔单抗耐药。当c-Src抑制剂达沙替尼及PP2作用于胃癌SGC-7901及MGC-803细胞，c-Src磷酸化被抑制的同时，EGFR及其下游AKT、ERK通路的磷酸化也被不同程度的抑制。接下来我们探讨了c-Src在RANKL介导的西妥昔单抗耐药中的作用。MTT实验证实了SGC-7901细胞单独应用达沙替的抑制率为24.6％±10.3％。对照组单独应用西妥昔单抗的抑制率高于联合应用RANKL(p=0.007)，而达沙替尼组二者无明显差异(p=0.319)。这些结果证明，应用达沙替尼逆转了RANKL诱导的西妥昔单抗耐药。Western blot检测信号通路显示：达沙替尼能够抑制RANKL对EGFR及其下游AKT、ERK通路的激活作用;对照组RANKL逆转了西妥昔单抗对EGFR通路的抑制作用，当应用达沙替尼预处理后解除了RANKL对西妥昔单抗的逆转作用。这些结果证明，c-Src可能在RANKL介导的胃癌细胞EGFR活化及对西妥昔单抗耐药起到重要的调节作用。　　6、RANKL/RANK通路同样介导了肠癌细胞对西妥昔单抗耐药　　我们对于RANKL/RANK通路诱导西妥昔单抗耐药的现象在RAS野生型的肠癌Caco-2细胞中进行了进一步验证。Western blot检测信号通路显示，RANKL上调了EGFR及其下游AKT、ERK通路的磷酸化水平。MTT检测细胞增殖能力显示：联合应用RANKL降低Caco-2细胞对西妥昔单抗的敏感性;沉默RANK后Caco-2细胞对西妥昔单抗的敏感性恢复。　　结论：　　1、胃癌组织中RANKL表达与EGFR表达呈正相关。　　2、RANKL/RANK通路能够通过激活EGFR通路诱导胃癌细胞对西妥昔单抗耐药。　　3、c-Src是RANKL/RANK通路诱导胃癌细胞对西妥昔单抗耐药的关键分子。　　4、RANKL/RANK通路同样能够降低肠癌细胞对西妥昔单抗的敏感性。