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1沉默CDC25A通过下调IL-6影响肝癌细胞增殖目的:探索CDC25A作为细胞分裂周期调控因子（cell division cycle25A）对肝癌移植瘤及HepG2细胞增殖的影响,并进一步探讨CDC25A与IL-6在肝癌中的相互作用关系及可能存在的作用机制。方法:通过慢病毒载体转染方式将LV-sh RNA-CDC25A转染HepG2肝癌细胞特异性地将CDC25A的表达沉默（CDC25A-sh RNA组）,并以LV-sh RNA-NC转染作为阴性对照（CDC25A-NC组）,以未转染的肝癌细胞组作为空白对照（Control组）。应用实时定量PCR（q RT-PCR）和蛋白免疫印迹（western blot）技术测定慢病毒的转染效率和细胞中IL-6以及IL-6信号轴相关因子（IL-1β、NIK、NF-κB）的表达。然后将30只4-6周BALB/c的雌性裸鼠应用计算机采用随机方法生成数字分为3组（n=10）:KD组、NC组和Control组,分别在裸鼠腋窝0.5-1.0cm处皮下接种对应的三组细胞。每周观察和记录移植瘤情况,5周后获取移植瘤组织。采用免疫组织化学、q RT-PCR及western blot技术测定移植瘤中CDC25A和IL-6的表达以及IL-1β、NIK、NF-κB的表达。结果:构建出稳定沉默CDC25A基因的人肝癌HepG2细胞,q RT-PCR和western blot结果显示CDC25A-sh RNA组CDC25A m RNA和蛋白的相对表达量均明显低于CDC25A-NC组、Control组,差异有统计学意义（p<0.05）。CDC25A-sh RNA组IL-6 m RNA和蛋白的相对表达量（0.36±0.05、0.40±0.05）均明显低于CDC25A-NC组（1.16±0.12、1.31±0.03）、Control组（1.00±0.09、1.25±0.04）（p<0.05）。CDC25A-sh RNA组中IL-1β、NIK、NF-κB m RNA相对表达量依次为0.56±0.07、0.49±0.07、0.58±0.04,蛋白相对表达量依次为0.45±0.06、0.24±0.05、0.63±0.06。CDC25A-NC组中IL-1β、NIK、NF-κB m RNA相对表达量依次为1.16±0.07、1.16±0.05、1.22±0.08,蛋白相对表达量依次为0.93±0.06、0.70±0.09、1.09±0.08。Control组中IL-1β、NIK、NF-κB m RNA相对表达量依次为1.01±0.12、1.04±0.11、1.08±0.12,蛋白相对表达量依次为0.88±0.12、0.73±0.07、1.08±0.11。可见,CDC25A-sh RNA组IL-6以及IL-6信号轴的相关因子（IL-1β、NIK、NF-κB）m RNA和蛋白的表达显著低于阴性对照组（p<0.05）和空白对照组（p<0.05）,差异具有统计学意义。移植瘤生长曲线结果显示KD组肿瘤生长速率明显低于NC组和Control组,而NC组和Control组生长速率无明显差异。测量三组瘤体平均体积依次为25.96±9.62mm~3、79.00±10.56mm~3、81.96±14.75mm~3。测得三组肿瘤平均重量依次为0.21±0.09g、0.47±0.10g、0.52±0.11g。可见KD组中肿瘤平均体积和平均重量均明显小于NC组和Control组,差异具有统计学意义（p<0.05）。免疫组织化学结果显示KD组CDC25A和IL-6比较于NC组和Control组均明显低表达,并且CDC25A和IL-6表达之间存在明显正相关关系（r=0.669,p<0.05）。q RT-PCR和western blot结果显示KD组CDC25A m RNA和蛋白的相对表达量（0.32±0.07、0.41±0.06）明显低于NC组（0.99±0.05、1.10±0.15）和Control组（1.05±0.10、1.06±0.11）,差异具有统计学意义（p<0.05）。同时,KD组IL-6 m RNA和蛋白的相对表达量（0.42±0.06、0.54±0.06）明显低于NC组（1.28±0.09、1.26±0.10）和Control组（1.00±0.04、1.21±0.07）（p<0.05）,差异具有统计学意义。移植瘤组织q RT-PCR和western blot结果显示KD组IL-1β、NIK、NF-κB m RNA相对表达量依次为0.60±0.08、0.53±0.07、0.62±0.08,蛋白相对表达量依次为0.51±0.06、0.30±0.07、0.75±0.05。NC组IL-1β、NIK、NF-κB m RNA相对表达量依次为1.23±0.14、1.13±0.09、1.46±0.10,蛋白相对表达量依次为0.94±0.02、0.69±0.05、1.32±0.02。Control组IL-1β、NIK、NF-κB m RNA相对表达量依次为1.00±0.13、1.01±1.14、1.00±0.09,蛋白相对表达量依次为0.91±0.02、0.68±0.05、1.28±0.08。可见,KD组IL-6信号轴的相关因子（IL-1β、NIK、NF-κB）m RNA和蛋白的表达显著低于阴性对照组（p<0.05）和空白对照组（p<0.05）,差异具有统计学意义。结论:1.沉默肝癌HepG2细胞中CDC25A可使IL-6及IL-1β/NIK/NF-κB信号轴的表达下调。2.构建肝癌裸鼠移植瘤模型,明确沉默HepG2细胞株中CDC25A基因明显减弱其增殖能力。CDC25A与IL-6存在正调控关系,CDC25A对IL-6的作用可能与IL-1β/NIK/NF-κB信号轴有关。2串联亲和纯化技术联合质谱鉴定CDC25A的相互作用蛋白目的:探索CDC25A在HepG2细胞中的互作蛋白,以期为后续研究其促进肿瘤发展机制提供思路。方法:构建带有Flag和TST双标签（串联亲和纯化标签）的CDC25A载体,采用琼脂凝胶电泳及测序技术检测双标签载体构建情况。然后构建含有上述双标签载体的过表达慢病毒,将其稳定转染至HepG2细胞中,并以过表达CDC25A-Flag-TST的细胞株作为实验组,空载慢病毒NC-Flag-TST转染的处理作为对照组,使用western blot技术验证两组细胞中CDC25A蛋白的相对表达量。采用串联亲和纯化技术将两组细胞进行脱洗,经过两次脱洗后,采用western blot技术检测纯化后的两组细胞蛋白液中CDC25A-Flag-TST融合蛋白的表达。将脱洗后的两组蛋白液进行质谱鉴定分析得到目的蛋白的相互作用蛋白,并应用生物信息学进行分析。通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）分别验证HepG2细胞中CDC25A与SPIN1、hnRNPQ的相互作用关系。结果:琼脂糖凝胶结果显示带有Flag及TST双标签的CDC25A载体构建成功。Western blot实验结果表明实验组CDC25A蛋白相对表达量显著高于对照组,说明含有Flag和TST双标签的过表达CDC25A细胞株构建完成。两次脱洗后的两组细胞蛋白液经western blot检测结果显示实验组中CDC25A-Flag-TST融合蛋白显著表达,而对照组中表达不明显。串联亲和纯化联合质谱（TAP-MS）结果获得CDC25A相互作用蛋白共44个。GO处理结果显示该44个蛋白参与细胞的多种生理活动,KEGG处理结果显示CDC25A的互作蛋白参与多种生化代谢途径和信号转导途径。String蛋白质互作网络图显示与CDC25A相互作用的部分蛋白之间具有密切联系。Co-IP实验结果显示在HepG2细胞系中CDC25A与SPIN1、hn RNPQ均存在相互作用关系。结论:采用串联亲和纯化联合质谱,成功筛选出在肝癌细胞HepG2中CDC25A的相互作用蛋白,其中CDC25A与SPIN1、hn RNPQ均存在相互作用关系。