禽类繁殖周期短，饲养成本低，禽蛋中蛋白成分简单便于分离纯化，并且其蛋白质的糖基化模式与人类较为相似，目前关于转基因禽类作为生物反应器生产药用蛋白的研究越来越受到科学家的青睐。但是在利用非病毒载体法制备转基因禽类的过程中，发现外源基因不能稳定整合于宿主基因组中，外源基因往往随着细胞的分裂丢失发生瞬时表达的现象，获得的转基因鸡不能遗传给后代。本试验尝试添加MAR调控序列增加外源人抑癌基因P53的整合稳定性，利用EGFP作为报告基因，在pEGFP-N1载体的调控下摸索出一条能够稳定遗传的转基因鸡模型。　　1.转人抑癌基因P53鸡的制备　　将本实验室构建好的真核表达载体 pEGFP-N1-P53/MAR注射鸡 X期胚盘的明区和暗区，分析注射 X期胚盘的不同位置孵化率的变化。试验共120枚种蛋，平均分为对照组、明区组、暗区组。对照组只进行简单的开窗、封口孵化处理。明区组是进行开窗后利用显微注射法将质粒载体 pEGFP-N1-P53/MAR注射到鸡胚盘 X期的明区位置，然后封口孵化；暗区组是开窗处理后显微注射暗区，然后进行封口孵化。提取孵化出壳的G0鸡基因组进行 PCR检测，筛选出含有外源基因的转基因 G0鸡。结果显示，暗区组的孵化率显著高于明区组（P＜0.05），对照组的孵化率分别显著高于明区组和暗区组（P＜0.05）。明区组无活鸡胚存活，暗区组18只鸡孵化出雏，经PCR检测和测序结果证明有4只鸡整合了人抑癌基因P53。　　2.人抑癌基因P53在转基因鸡后代中的表达研究　　将筛选的4只转基因 G0鸡饲养至性成熟，通过人工授精技术获得了65只G1鸡，经PCR和绿色荧光蛋白信号检测，发现有2只G1鸡基因组中确实整合了人抑癌基因P53，提取转基因G0和G1鸡的总蛋白进行Western blot检测，结果显示转基因G0和G1鸡体内均含有外源蛋白P53。　　3.人抑癌基因P53在人癌细胞中的表达研究　　为研究 pEGFP-N1-P53/MAR质粒载体转染 P53基因功能缺陷的人肝癌细胞Hep3b细胞，研究人抑癌基因P53的表达活性。试验分为三组，分别为空白对照组，空载体组，试验组即分别在 Hep3b细胞中转染 PBS、pEGFP-N1、pEGFP-N1-P53/MAR。结果显示：在转染后的第24 h转染效率最高，从细胞形态上进行观察，空白对照组、空载体组细胞贴壁良好，细胞形态正常随着转染时间的增长无细胞死亡现象；试验组在转染后出现细胞皱缩变圆、细胞间的连接消失并随着转染时间的延长，细胞开始大批量的出现程序性死亡。分别将三组细胞在转染后的第24 h收集起来，做细胞超薄切片并在透射电镜下观察三组细胞的超微结构变化。发现空白对照组线粒体脊明显，粗面内质网形态正常，细胞核结构无异染色质、无核边集、无凋亡小体等细胞凋亡现象；空载体组与空白对照组超微结构上相似，仅仅线粒体有略微肿胀，无凋亡现象。但是试验组线粒体肿胀，内质网出现扩张现象，细胞核结构上有异染色质出现，并且边集于细胞核形成新月状，凋亡小体的出现等典型的凋亡现象。　　结论：利用 MAR序列调控元件可以提高外源基因在转基因鸡基因组中的整合稳定性，并且 pEGFP-N1-P53/MAR质粒载体转染人癌细胞能够表达有活性的P53蛋白。