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脂肪酶(lipase, EC 3.1.1.3),全称三酰甘油酰基水解酶,广泛存在于生物体内。它能够催化油脂上甘油酯键的水解,也可催化酯交换、酯化、醇解和酸解等反应。微生物来源的脂肪酶由于作用多样、易于培养、产量丰富等特点而被广泛用于工业生产,其中热稳定脂肪酶的研究和开发更是具有重要的商业价值。疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一种分布广泛、生长上限温度较高的真菌。它能够产生热稳定的具有重要工业价值的脂肪酶,但是野生菌产酶存在培养温度高等较多不利因素,因而近年来主要研究方向集中于采用基因工程方法构建重组菌,进而表达获得脂肪酶。本研究中T.lanuginosus在添加橄榄油的诱导培养基上产生了脂肪酶。根据已报道的脂肪酶同源保守序列,以及GenBank已注册的T.lanuginosus脂肪酶序列(AF054513)设计特异引物,综合运用PCR、RT-PCR、Tail-PCR技术克隆到两个脂肪酶基因的全长DNA和cDNA序列,将两个基因分别命名为lgy和ln。其中lgy基因DNA序列长1071bp,有3内含子;cDNA序列长885bp,开放阅读框编码291个氨基酸,其中前17个氨基酸构成信号肽,序列提交GenBank,登录号分别为EU022703和EU370914。ln基因DNA序列长1209bp,含有3个内含子;全长cDNA序列为1095bp,包含一个编码291个氨基酸的开放阅读框,前17个氨基酸构成信号肽。序列在Genbank中注册,登录号为EU004197和EU004196。比对分析由核苷酸序列推导的相应氨基酸序列,发现两个脂肪酶均具有G-H-S-L-G,即霉菌脂肪酶保守序列。二者氨基酸同源性为78.69%。将基因lgy和ln分别与酵母分泌型表达载体pPIC9K双酶切后体外连接,构建酵母重组表达载体pPIC9K/lgy和pPIC9K/ln,并测序保证正确的阅读框。将重组表达质粒pPIC9K/lgy、pPIC9K/ln和pPIC9K空质粒分别用限制性内切酶SacⅠ(位于5’AOX1区内)线性化后,采用电击法转化Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞,于MD/MM平板上筛选His+Mut+表型的酵母转化子。经过PCR检测及G418抗性筛选多拷贝整合子,进行甲醇诱导培养。通过检测各转化子每隔24h的蛋白表达情况来筛选高效表达目的脂肪酶的工程菌株。筛选到表达酶活性最高的菌株GS-LGY-3和GS-LN-6,甲醇诱导均为6d酶活性达到最高,分别达7.2 U/mL和6.1U/mL。检测目的蛋白的表达量及遗传稳定性,并测定表达脂肪酶的酶学性质。酵母工程菌株GS-LGY-3和GS-LN-6在YPD平板上划线,连续传代10次后,PCR检测呈阳性,重组脂肪酶的表达量基本保持稳定。表达脂肪酶LGY的最适反应温度和pH分别为60℃和8.0,该酶在60℃以下稳定,70℃的半衰期为15min,在pH值为6.0~9.0之间表达脂肪酶保持稳定的酶活性;表达脂肪酶LN的最适反应温度和pH分别为60℃和9.0,该酶在60℃下稳定,80℃半衰期为30min,90℃条件下半衰期是18min,比LGY热稳定性更好,在pH值为9.0~11.0之间表达酶活性较稳定。两种重组酶在金属离子存在的环境中表现相似,Ca2+对酶有明显的激活作用,Li+、Mg2+、Na+、Ba2+对酶影响不大,Fe2+、Zn2+、K+、Ag+对酶有显著的抑制作用。T.lanuginosus脂肪酶能在毕赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白,而且表达产物同样具有原始菌株T.lanuginosus脂肪酶的优良特性(在60℃下1h内稳定,最适反应温度较高达到60℃),这预示了表达脂肪酶在生物学领域和化工工业的广阔应用前景。因此,期望能对该基因进行分子改造、表达条件的进一步优化,以获得真正有工业应用价值的酵母工程菌株。