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脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是脊柱损伤最严重的并发症,往往导致损伤节段以下严重的功能障碍。SCI具有较高的致残率及致死率,给个人、社会带来沉重的负担。针对脊髓损伤的预防、治疗和康复已成为当今医学界的一大课题。脊髓神经细胞再生困难及生长速度缓慢,造成了神经组织损伤后很难恢复。因此,脊髓损伤的病理和修复机制主要集中在脊髓继发性损伤的预防和可逆调控上。神经元的凋亡是SCI继发性损伤的重要机制。因此,主要策略是减少神经元损伤,抑制细胞凋亡,并控制炎症反应以促进脊髓修复。而近年来的热点线粒体自噬也值得我们进一步探索。近年来,BNIP3被发现不仅参与凋亡过程,且通过多种机制参与自噬发生发展。因此BNIP3作为两者的关键蛋白,其在SCI中的机制仍需进一步的探讨,旨在BNIP3位切入点,探索调控自噬与凋亡的平衡,减少脊髓神经元的凋亡。第一部分:PC12诱导分化建立机械损伤体外模型观察自噬的表达规律目的:探索PC12神经元机械损伤后自噬、BNIP3的表达规律及膜电位的变化规律。方法:(1)PC12细胞的培养与传代,并使用NGF对PC12进行分化诱导,培养至第74天按照阙海萍[18]方法建立体外神经元机械损伤模型;(2)在机械损伤后不同时间点(0h、1h、4h、8h、24h)提取胞浆蛋白,使用western blot分析自噬(LC3、P62)和BNIP3的表达情况;(3)使用JC-1试剂盒在损伤后不同时间点检测线粒体膜电位水平。结果:(1)LC3II/I在损伤后4h开始增加(P<0.05),自噬底物P62伴随着减少(P<0.05);(2)使用自噬溶酶体抑制剂BAF(100nM),LC3II/I明显增长(P<0.05),但自噬底物P62伴随积累(P<0.05);(3)损伤后8小时,JC-1绿/红荧光比值出现明显增高(P<0.05);(4)BNIP3在损伤8小时后呈显著增加,随后持续增长,24小时达峰值(P<0.05)。结论:损伤后的4小时检测到了自噬的启动标志,与既往的原代脊髓神经元得到相同的结果。验证了我们模型的建立以及自噬流的存在。且膜电位在损伤后8h也出现了明显的改变,随时间呈正性相关,在24小时达峰值。同时我们也探索了机械损伤中BNIP3的表达规律,在损伤后8小时开始显著增加,呈正性相关(P<0.05)。可见线粒体膜电位与BNIP3的表达可能具有相关性,且都晚于自噬流的产生。第二部分BNIP3过表达与沉默对机械损伤PC12神经元的作用目的:探索在PC12神经元机械损伤后BNIP3过表达与沉默对自噬和凋亡的调控规律,以及对损伤后PC12神经元活力的影响。方法:(1)检测慢病毒感染稳转株BNIP3的表达特点,是否符合要求;(2)建立4各组(sham组、SCI组、SCI?BNIP3过表达组、SCI?BNIP3sh RNA组)。同第一部分建立机械损伤模型;并在损伤后24h提取蛋白,检测自噬相关蛋白的表达;(3)损伤后24h检测各组间线粒体膜电位水平;(4)损伤后24h通过tunel检测细胞的凋亡情况;(5)损伤后24h通过流式Annexin-FITC/PI双染法测凋亡及细胞活力。结果:(1)LC3II/I的检测,SCI组、SCI?BNIP3过表达组、SCI?BNIP3 sh RNA组均明显增高(p<0.05,相对于sham组);SCI组和SCI?BNIP3 sh RNA组之间无明显的统计学意义(p>0.05);SCI?BNIP3过表达组相对于SCI组、SCI?BNIP3sh RNA组均明显升高。(p<0.05)。以上结果证实了BNIP3的过表达能够增强自噬流,但BNIP3沉默时对自噬流无明显影响。考虑这可能是存在着其他的代偿机制。(2)流式检测凋亡和TUNEL检测凋亡的结果相似。SCI组、SCI?BNIP3过表达组、SCI?BNIP3 sh RNA组细胞凋亡比值均呈现明显增高(p<0.05,相对于sham组);SCI组和SCI?BNIP3 sh RNA组之间无明显的统计学意义(p>0.05);SCI?BNIP3过表达组相对于SCI组、SCI?BNIP3 sh RNA组凋亡比值显著下降。(p<0.05)。而细胞活力情况则与之相反。(3)上述结果示:在机械损伤PC12神经元24小时内,过表达BNIP3的细胞株自噬流明显增强(p<0.05),细胞凋亡显著降低(p<0.05),细胞活力情况相对于SCI组和BNIP3沉默组明显增高(p<0.05)。结论:BNIP3可能通过MPT、与BCL-2结合的竞争、抑制Rheb三种机制调控自噬的流。在机械损伤PC12神经元24小时内,过表达BNIP3可增强自噬流,抑制凋亡的发生,使细胞活力升高。而沉默BNIP3与正常细胞株无明显差异,可能存在其他代偿机制。