溶菌酶在自然界有广泛的分布,全称1,4-β-N-乙酰胞壁酸聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrolase),简称胞壁酸酶或胞壁质酶(muramidase)溶菌酶作为一种先天非特异免疫防御因子,在机体对抗感染性病原菌中发挥重要作用。根据其物种来源以及结构、分子量的不同可分为以下六种类型：鸡型溶菌酶(chicken type,c型)；鹅型溶菌酶(geese type,g型)；无脊椎动物溶菌酶(invertebrate type,i型)；植物溶菌酶；微生物溶菌酶；噬菌体溶菌酶(phage type,p型)。C型溶菌酶是分布最广泛也是唯一同时在脊椎动物和无脊椎动物中存在的类型,因此人们对c型溶菌酶的研究也最为深入。LYC1 (LYZL6)是本实验室发现和克隆的一个新的人c型溶菌酶家族基因。对LYC1蛋白序列的分析表明,它与人溶菌酶氨基酸序列上的一致性达到44%,并具有c型溶菌酶保守的8个Cys残基以及Glu-35和Asp-52催化残基。本研究通过建立和应用毕赤酵母表达系统,依据毕赤酵母的密码子偏好特性人工合成了去除自身信号肽的LYC1基因序列,并构建毕赤酵母a-因子信号肽引导表达具有天然N端LYC1的重组pPIC9k-LYC1分泌型毕赤酵母载体。将线性化重组质粒电转入毕赤酵母菌株GS115和SMD1168中,使其定点整合进毕赤酵母基因组中。通过营养筛选以及多拷贝筛选,获得稳定整合表达载体的多拷贝插入菌株。通过摇瓶培养和诱导,筛选出表达能力强的重组菌株,并优化表达条件。进一步在30L发酵罐上进行发酵研究,通过控制发酵工艺如转速、通气量、甘油/甲醇流加方式、温度、pH等参数以及添加补料,使蛋白表达量得到了提升,为接下来的纯化工作提供了一定量的目标蛋白。SDS-PAGE显示LYC1重组蛋白发酵上清呈现不均一性,可能是重组蛋白发生了降解、糖基化或聚集导致。对样品的质谱分析证实了LYC1的表达。GS115重组菌株蛋白表达量较SMD1168为少,这可能因为GS115表达蛋白降解更为严重。优化发酵条件,及添加补料在一定程度上提高了表达量。活性测试表明,在SMD1168的发酵上清中检测到了溶菌活性,但与H-LYZ相比较弱。这可能是由于LYC1表达量不高,或者发生了降解或其他修饰；LYC1底物特异性及最适反应条件不同于H-LYZ,尤其是考虑到两者等电点有较大差异；LYC1的主要作用并非抗菌,而是承担了其它的功能。我们将对其性质和具体功能作进一步的探究。