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目的:探讨在脑缺血预处理、缺血再灌注损伤过程中,微小RNA(microRNA,miRNA)表达谱的变化,以及差异表达的miRNAs的初步功能。利用高通量微阵列芯片技术研究脑缺血再灌注模型组(I/R组)、缺血预处理组(CIP组)与假手术组(Sham组)大鼠海马miRNAs表达的差异,建立差异的miRNA表达谱,筛选出表达差异显著的基因,进行芯片结果的PCR验证。对差异表达的基因进行初步生物信息学研究。从基因组学层面上解释脑缺血预适应及缺血再灌注损伤发病机制及阿托伐他汀保护作用机制,为缺血性脑卒中预防和治疗提供新的思路或途径。方法:选取3-4月龄SPF级健康雄性SD大鼠,随机分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、缺血预处理组(CIP组)、阿托伐他汀预处理组(Ator组),每组33只。I/R组:生理盐水按照10mg/kg体重灌胃7d,采用线栓法制作大鼠右大脑中动脉阻塞模型(MCAO),给予右侧大脑中动脉阻断2h后恢复灌注1d;采用大脑中动脉二次线栓法制备CIP模型:等量生理盐水灌胃7d,缺血再灌注前,给予右侧大脑中动脉阻断10min,复灌1d后,再次阻断血流,缺血2h,复灌1d;Ator组:术前7d给予Ator 10mg/kg灌胃,给予右侧大脑中动脉阻断2h后恢复灌注1d;Sham组:等量生理盐水灌胃7d,仅分离颈总动脉,不栓塞。实验周期完成后,分别对各组大鼠进行神经行为学评分;每组再灌注后1d各选6只大鼠,断头取脑,采用TTC染色法计算脑梗死体积比;制备海马组织石蜡切片并进行HE染色观察大鼠海马CA1区神经元细胞存活情况。留取大鼠海马组织,提取、纯化海马组织的总RNA,合成c RNA,制备基因芯片,进行数据分析。将Sham组与I/R组、CIP组分别进行两组间比较,得出差异变化的miRNAs的表达谱。选取差异表达上调及下调倍数较高,且符合筛选标准的数个miRNAs进行实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测,对基因芯片结果进行验证。对差异表达的miRNAs进行GO分析,获得参与脑缺血预处理、缺血再灌注过程中差异表达的miRNAs的生物学信息,与具体基因联系起来,对其功能进行描述。查询检索KEGG数据库,从中获得差异表达的miRNAs参与的信号通路注释,进一步阐述这些基因的作用机制。结果:1、本实验利用雄性SD大鼠制备了脑缺血再灌注模型、缺血预处理模型、阿托伐他汀钙预处理模型,造模总成功率83.3%,模型制备理想。2、通过对各组大鼠神经行为学检测,发现CIP组和Ator组相对于I/R组神经行为学评分明显减轻(P=0.003,0.001),Ator组和CIP组之间神经行为学评分差异不明显(P=0.165)。这些说明缺血预适应(CIP)、药物预处理(Ator)能够显著改善MCAO导致的大鼠运动功能障碍。检测各组大鼠脑梗死体积发现CIP组和Ator组相对于I/R组脑梗死体积比明显减少(P=0.007,0.016),Ator组和CIP组之间脑梗死体积比差异不明显(P=0.649),说明缺血预适应(CIP)、药物预处理(Ator)能够显著减小MCAO导致的大鼠脑梗死的体积。3、通过对各组大鼠组织形态学变化的观察,缺血预适应和阿托伐他汀钙预处理能够显著改善MCAO导致的大鼠海马CA1区神经元细胞形态,减小缺血侧梗死体积,具有神经保护作用。4、利用高通量微阵列芯片技术,对I/R组、CIP组、Sham组大鼠海马miRNA的表达谱进行分析,筛选出差异表达的miRNAs:其中与Sham组比较,I/R组中有29个miRNAs表达上调,35个miRNAs表达下调;与Sham组比较,CIP组中有64个miRNAs表达上调,4个miRNAs表达下调;与CIP组比较,I/R组中有12个miRNAs表达上调,67个miRNAs表达下调。5、在I/R组、CIP组与Sham组差异表达的miRNAs谱中,进行同向性筛选,筛选出具有同向性表达上调的miRNAs有6条。我们首次报道了4个新miRNAs在I/R组、CIP组与Sham组三组之间存在同向性高表达的情况。同时我们发现rno-miR-3068-3p在I/R组、CIP组与Sham组三组之间存在同向性高表达(首次报道),这一个比较特殊的miRNA引起了我们的重视和兴趣。我们在进行上面基因芯片q RT-PCR结果验证的时候,同时对Ator组大鼠海马组织中的miRNAs表达量进行了检测,结果发现Ator组相对于I/R组rno-miR-30b-5p表达水平明显上调。6、对差异表达的基因进行GO及KEGG pathway分析以获得miRNA的相关功能和信号通路。GO聚类分析结果显示在脑缺血预处理、缺血再灌注过程中,差异表达基因功能主要参与:细胞因子受体活性、钙离子通道、跨膜信号受体活性、神经元分化与投射等;KEGG数据分析结果提示差异表达rno-miR-3068-3p可能参与了靶基因为腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMKP)调控细胞能量稳态的信号通路。7、利用生物信息学分析技术构建出rno-miR-3068-3p—Transcriptional Factors(STRAD和TBC1D1)—AMPK的调控网络模式。8、利用q RT-PCR技术,对差异表达的miRNAs进行验证,与基因芯片结果相一致;提示miRNAs参与了大鼠脑缺血预处理、缺血再灌注的病理过程,发挥了生物学作用。结论:脑缺血预处理和缺血再灌注使大鼠海马组织中miRNAs的表达谱发生了变化,且差异显著,提示miRNAs可能参与了缺血性脑卒中发生发展的基因调控。阿托伐他汀预处理起到的神经保护作用亦可能与miRNAs有关。