滇金丝猴粪便微生物宏基因组来源几丁质酶和β-半乳糖苷酶的研究

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几丁质酶(EC 3.2.1.14)通过断裂N-乙酰-D-氨基葡萄糖间的β-1,4-D-糖苷键将几丁质降解为不同聚合度的壳寡糖,被进一步开发和广泛利用,在避免资源浪费的同时也缓解了环境污染问题。β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)通过断裂乳糖中的β-1,4-D-半乳吡喃糖苷键将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖,使人体更好地吸收和利用,在食品等领域应用广泛。目前,开发研究不同来源、具有更好特性的新型几丁质酶和β-半乳糖苷酶对于进一步扩大几丁质酶和β-半乳糖苷酶的应用领域和范围具有重要意义。动物胃肠道中存在大量、独特的微生物菌群,与动物的机体免疫、食物消化等方面密切相关,同时动物胃肠道微生物又是一个相对独立、巨大待开发的酶基因资源库,因此从中挖掘各种微生物酶资源并进行研究和开发利用具有重要意义。本论文从已构建的滇金丝猴粪便微生物宏基因组文库出发,结合生物信息学分析,以Fosmid质粒DNA为模板,利用PCR扩增获得几丁质酶基因chitiRBM1和β-半乳糖苷酶基因galRBM1,在Escherichia coli BL21(DE3)中异源表达并纯化后,对重组酶进行了相关性质及初步应用研究。结果如下:(1)重组几丁质酶ChitiRBM1的最适温度为50℃,最适pH为6.0,最适底物为胶体壳聚糖,对应的Km、Vmax以及Kcat分别为4.2419 mM,52.63μmol/h/mg,0.7252 min-1。在30℃、40℃条件下耐受20 h,保持70%以上相对酶活。pH5-9条件下耐受20 h,剩余70%以上的相对酶活。0-15%NaCl条件下耐受12 h后,该酶保持80%以上的相对酶活,终浓度30%NaCl条件耐受12 h下仍保留30%以上相对酶活。10mM终浓度的Mn2+、Fe2+对galRBM1酶活具有强烈激活作用,终浓度10mM Co2+和1%β-毓基乙醇对其酶活有明显促进作用,而终浓度10mM的Cu2+、Fe3+、Ag+、Ni2+、1%Tween-80对其酶活具有明显抑制作用,其余离子或试剂则对重组酶的酶活无明显影响。(2)β-半乳糖苷酶galRBM1的最适温度为50℃,最适pH为7.0,最适底物为ONPG(邻硝基苯β-D-吡喃半乳糖苷),对应的Km、Vmax以及Kcat分别为0.9862 mmol/L,5.2966 mmoL/min/mg,3.0896 s-1。在30-50℃条件下耐受4 h,剩余酶活保持85%以上。在pH3和pH4酸性条件下耐受1 h,剩余相对酶活分别为17.46%和37.87%,pH5-10范围内,酶活均保持80%以上,pH11的强碱条件下仍有70%以上的酶活。0-10%NaCl条件下耐受1 h,相对剩余酶活均保持80%以上,30%NaCl条件下耐受l h其相对酶活仍剩余40.87%。终浓度10mM的Fe3+,Fe2+对重组酶galRBM1酶活具有强烈激活作用,Cu2+、Ag+、1%Tween-80对其酶活具有明显抑制作用,其余金属离子及化学试剂无明显影响。综上,本研究获得一个几丁质酶和β-半乳糖苷酶,兼具pH耐受范围广且pH、温度稳定性良好,可耐受多种金属离子并具有较好的耐盐性等优良工业特性,使其在医药、食品、农业及乳制品加工和开发等领域中具有应用潜力。
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