研究背景:缺血后处理可通过激活内源性保护通路减轻组织缺血再灌注(I/R)损伤,但是其在老年患者中是否仍存在保护作用尚存争议。长链非编码RNA(lncRNA)H19在缺血性疾病中发挥着重要作用,但是其在老化心肌中的功能尚不明确。在临床和基础研究中,右美托咪定具有心肌保护作用,但其在老化心肌I/R损伤中发挥的功能和机制仍待进一步研究。RNAN6-甲基腺嘌呤甲基化(N6-methyladenosine,m6A)是内源性最为常见的RN A修饰方式。有研究表明,肿瘤细胞缺氧后会引起细胞总体的RN A m6A修饰增加,而lncRNA本身也可被m6A修饰。因此本研究将探讨H19在老化心肌缺氧后处理及右美托咪定缺氧后处理中发挥的作用及机制,缺氧后处理及右美托咪定缺氧后处理对老化心肌细胞RNA m6A的修饰水平的影响,RNA m6A修饰调控基因对lncRNA H19表达调控以及其在老化心肌缺氧复氧、缺氧后处理中发挥的作用。实验方法:分离培养原代心肌细胞,用分别用0g/L,5g/L,10g/L,20g/L,40g/L浓度D-半乳糖处理加速细胞衰老,使用SA-β-gal染色及衰老相关蛋白检测衰老情况。原代正常心肌细胞及衰老心肌细胞经缺氧复氧、缺氧后处理,通过CCK-8检测细胞活力,通过流式细胞术及相关凋亡蛋白表达情况检测凋亡,以评估心肌细胞损伤,并用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测H19表达情况。通过生物信息学分析,筛选出下游可能结合的microRNA及靶基因。在心肌细胞系H9c2中过表达或敲低H19,探讨其对下游基因的调控作用,并用双荧光素酶报告基因系统验证结合位点。通过CCK-8、流式及凋亡蛋白表达检测以评价H19、下游调控的microRNA及靶基因在老化心肌缺氧后处理中的功能。使用过氧化氫(H2O2)处理4h以诱导心肌细胞系H9c2细胞衰老,24h后进行缺氧复氧实验,缺氧6h后使用终浓度为0,500nM,1μM,2μM的右美托咪定处理6 h,更换正常培养基继续培养6 h后检测各处理组心肌细胞损伤情况。下一步在老化心肌细胞中敲低H19及其调控的下游基因,进行右美托咪定缺氧后处理实验,检测心肌细胞损伤情况。通过比色法检测缺氧复氧组、缺氧后处理组、右美托咪定后处理组RNAm6A总甲基化水平,筛选缺氧复氧后表达差异的RNAm6A甲基化调控基因,通过m6ARNA免疫沉淀实验(MeRIP)进一步验证其对H19表达调控的机制。最后检测筛选出的RNAm6A甲基化调控基因在老化心肌细胞缺氧后处理中发挥的作用。结果:缺氧后处理可以减轻正常心肌细胞缺氧复氧损伤,但是在老化心肌细胞中并无明显保护作用。与正常心肌比较,H19在老化心肌细胞缺氧后处理时表达下降。敲低H19时会增加老化心肌细胞缺氧后处理损伤。H19可以调节下游miR-29b-3p的表达,miR-29b-3p过表达时会增加老化心肌细胞缺氧后处理损伤,其机制是通过结合下游靶基因cIAP1的3’非翻译区(3’-UTR),抑制其表达,并且cIAP1的表达亦受到H19的间接调控,敲低cIAP1会增加老化心肌细胞缺氧后处理损伤。右美托咪定后处理可减轻老化心肌细胞缺氧复氧损伤,并通过H19/miR-29b-3p/cIAP1发挥作用。老化心肌缺氧复氧和缺氧后处理时细胞总体RNA m6A甲基化水平增加,去甲基化酶ALKBH5表达下降,而右美托咪定后处理可降低缺氧复氧引起的RNA m6A甲基化的增加,升高ALKBH5的表达。敲低AKLBH5后,H19的m6A的修饰程度增加,表达下降,老化心肌缺氧后处理损伤增加。而右美托咪定缺氧后处理会减轻敲低ALKBH5后引起的老化心肌细胞缺氧复氧损伤。结论:老化心肌细胞缺氧后处理不能改善缺氧复氧损伤,右美托咪定缺氧后处理具有抗缺氧复氧损伤的作用。H19可通过miR-29b-3p/cIAP1通路在老化心肌缺氧后处理中发挥作用。ALKBH5通过改变H19的m6A甲基化程度来调控其表达,并在老化心肌缺氧后处理中发挥保护作用。老化心肌右美托咪定缺氧后处理可通过调控ALKBH5发挥保护作用。