热休克蛋白90（Hsp90）是一种广泛存在于细胞中的分子伴侣，参与调控细胞内多种生理过程，包括细胞周期调控、细胞生存、凋亡、激素和其他多种信号通路。研究表明Hsp90在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥十分重要的作用，已经成为目前研究的热点和抗肿瘤治疗的良好靶点。自第一个Hsp90抑制剂进入临床实验以来，目前已经有多个不同的Hsp90抑制剂处于临床研究阶段，如17-DMAG、17-AAG、IPI-504、BII021、STA-9090、SNX-5422等。实验室在前期研究中发现多硫代二酮哌嗪类化合物HDN-1在体外对多种肿瘤细胞具有明显的抑制活性，且对Hsp90ATPase具有一定的抑制作用，并引起Hsp90顾客蛋白EGFR的降解。这些提示HDN-1具有靶向Hsp90的作用，可能为一种新型Hsp90抑制剂。本论文旨在进一步阐明HDN-1靶向抑制Hsp90的分子作用，明确HDN-1是一种新型的Hsp90抑制剂，从而揭示HDN-1抗肿瘤的作用机制。第一部分：HDN-1与Hsp90相互结合的研究本部分实验首先通过表面等离子共振技术（SPR）研究HDN-1与Hsp90的相互作用，结果表明HDN-1可与Hsp90发生结合，解离常数KD=10.9μM；采用基于荧光偏振原理的Hsp90抑制剂筛选模型对HDN-1进行评价，结果HDN-1不能与GA竞争性结合Hsp90，表明HDN-1不能与Hsp90N-端结合；通过观察HDN-1对胰蛋白酶水解Hsp90蛋白指纹图谱的影响，发现HDN-1与Hsp90N-端抑制剂17-AAG的作用不同，表明HDN-1确实不是作用于Hsp90N-端；进一步考察HDN-1与17-AAG联合应用对H1975细胞增殖的抑制作用，发现两者联用具有单独相加作用，说明HDN-1可能作用于Hsp90C-端；最后应用计算机分子模拟对接技术研究了HDN-1与Hsp90的结合部位，结果表明HDN-1与Hsp90分子的C-端结合。综上，HDN-1可与Hsp90结合，并且可能与Hsp90C-端发生结合。第二部分：HDN-1对Hsp90相关功能的影响1．细胞内Hsp90顾客蛋白超过200个，抑制Hsp90会引起顾客蛋白的降解。Western Blot方法检测HDN-1作用于3种非小细胞肺癌株H1975、A549、HCC827细胞对Hsp90顾客蛋白的影响，结果表明HDN-1引起了3种细胞中Hsp90顾客蛋白EGFR、p-EGFR、Stat3、p-Stat3、Raf、Akt、p-Akt、Erk、p-Erk、CyclinD1的降解和活性抑制。HDN-1在0.1μM浓度下就能引起吉非替尼耐药细胞株H1975细胞Hsp90顾客蛋白的变化，相比其它2种细胞，H1975细胞对HDN-1的作用更加敏感。2．缺氧是肿瘤生长中普遍存在的现象，缺氧环境与肿瘤的发生密切相关，HIF-1α是参与该过程的重要转录因子。Hsp90通过与HIF-1α的相互结合可以起到促进HIF-1α的正确折叠、维持其在缺氧环境下稳定性的作用。为进一步证明HDN-1具有抑制Hsp90的作用，通过Western Blot方法考察HDN-1在缺氧条件下对H1975和A549细胞中HIF-1α含量的影响，结果表明HDN-1可以明显引起细胞内HIF-1α蛋白水平的下调。3．研究显示，EGF介导的EGFR内吞降解与Hsp90密切相关，尤其是对发生突变的EGFR。该部分内容研究了HDN-1促进EGF介导的EGFR内吞降解的作用，结果发现：EGF可以诱导野生型EGFR的下调（A549细胞）但不能诱导突变型EGFR的下调（H1975和HCC827细胞），而HDN-1可以明显促进细胞中EGF介导的EGFR内吞降解，呈现剂量和时间依赖性，且对两种突变细胞中的EGFR作用更加明显，同时HDN-1也引起了3种细胞中p-EGFR（Tyr1045）含量上升，也具有剂量和时间依赖性，最后通过研究HDN-1对A549细胞中EGFR泛素化的影响，结果发现HDN-1引起A549细胞中EGFR泛素化增加。上述结果表明HDN-1通过抑制Hsp90的作用促进了EGF介导的EGFR内吞降解。本部分实验表明，HDN-1引起三种细胞中多种顾客蛋白的降解具有剂量和时间依赖性，且对H1975细胞的作用最为明显，并且HDN-1引起HIF-1α蛋白水平的下调；HDN-1通过抑制Hsp90的作用促进了EGF介导的EGFR内吞降解，且对两种突变EGFR作用更加明显。综上，我们明确了HDN-1是一种新型Hsp90抑制剂，这也是首次发现多硫代二酮哌嗪类具有Hsp90的分子靶向作用。本文阐明HDN-1的Hsp90抑制作用揭示了HDN-1的抗肿瘤作用机制，也为今后进一步对这类化合物基于靶向Hsp90的分子优化与药物开发奠定了基础。