新型细胞内信息分子荧光检测探针的设计、合成与性能研究

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生物活性小分子如活性硫族(RSS)、活性氧族(ROS)、活性氮族(RNS)等,在生物体内具有至关重要的作用。这些微量存在的生物小分子在体内保持着复杂而精细的动态平衡,并参与调节各种生化、生理过程,对维持生命体的健康发展起着不可或缺的作用。它们在生物体内的含量异常波动(升高或降低)与一些疾病的发生、发展密切相关。因此,检测这些生物活性分子对探讨相关分子参与的生理病理过程、阐释其与相关疾病的关系,以及研究生物信号传输通路和复杂环境下生物网络的运作过程等显得尤为重要。近年来发展的荧光技术,以其简便、快捷、灵敏、无损检测等优势成为研究热点。而开发灵敏性高、选择性强、稳定性好、生物相容性优良,新型的荧光探针是研究者们共同面临的课题。  硫化氢(H2S)是继NO、CO之后发现的第三种生物信息分子,目前,围绕H2S的灵敏性检测引起探针研究领域的极大关注。本文基于相关机制设计、合成了三类硫化氢荧光探针,探针结构均通过1H-NMR,13C-NMR,HR-MS等波谱方法确认。Probe1是基于硫化氢分子双亲核加成反应的“On-Off”型荧光探针,其制备方法简便,原料易得。该探针能够在缓冲溶液下识别硫化氢分子,检测限达到0.12 M,特别是,该探针在活细胞内能够选择性识别硫化氢分子,该识别过程通过激光共聚焦实验得以验证。作者采用核磁滴定与质谱研究了Probe1识别硫化氢的作用机制,首次提出罗丹明体系中硫化氢与醛基反应生成含硫半缩醛由于H2S的双亲核性进一步亲核加成关环的识别机制。另外,本文利用硫化氢亲核加成二硫键的反应机制,设计、合成了三个不同发射波长的荧光探针,拓展了二硫键结构在硫化氢检测探针设计中的应用。分别采用了单羟基大黄素,4-甲基-7-羟基香豆素,4-羟基氟硼吡咯作为报告荧光团,合成了三种荧光探针,Probe2,Probe3,Probe4,实验结果表明,Probe4响应性更快,而Probe3的检测限最低,荧光量子产率更高,能较好的应用于细胞中硫化氢的检测。而NBD缀合羟基萘酰亚胺的Probe5是基于硫化氢硫解苯醚键的作用机制。Probe5在缓冲溶液中的检测限为0.44 M,该探针也成功应用于检测细胞中外源性硫化氢。  谷胱甘肽是肿瘤细胞内高含量的含巯基分子,为了实现对其高灵敏检测,本文基于谷胱甘肽与醛基的特殊反应机制设计了一种新型“Off-On”荧光探针Probe6。通过光谱研究发现该探针能高效率地选择性识别谷胱甘肽与其他含硫氨基酸。在生理缓冲体系,其检测限达到2.4 M。此外,该探针在活性细胞中成功测试谷胱甘肽,探针选择性响应谷胱甘肽的机制通过HPLC-MS和DFT计算得以验证,本文所发现的谷胱甘肽识别机制是一种未见文献报道的新型作用机制,有望在设计新型GSH选择性荧光探针中得到应用。  为开发新型荧光母核,本文合成了七个基于萘酰亚胺母核的新型染料,该系列化合物受取代基的电子效应影响,颜色变化较大,在二氯甲烷中显示较强荧光,其中Probe7f对pH有敏感的响应性,紫外光谱与荧光光谱实验表明它是一种比率型pH探针特性。通过核磁滴定与DFT计算研究,阐述了该探针的作用机制,为进一步开发性能优良的pH探针提供了设计思路。
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