研究背景肿瘤是目前对人类健康和生命威胁最大的疾病之一，而肺癌是当今世界各国常见的恶性肿瘤，其发病率及死亡率位居癌症之首。脱落酸（Abscisic acid，ABA）是植物体内天然存在的一种激素，目前认为其在植物胚胎发育、种子休眠、果实成熟、逆境胁迫等多方面具有重要的生理功能，这些大都通过钙离子进行调节。与植物相似的是，在调节细胞分化、细胞防御及组织重构等方面钙离子在动物体内也起到了重要作用。然而，关于ABA对肺腺癌细胞系的作用国内外尚未有相关报道。自噬本是细胞通过自我消化维持生长的一种方式，但当自噬水平超过细胞的承受能力时，自噬可能诱导细胞凋亡。我们前期已对肺腺癌组织及癌旁组织中自噬相关蛋白表达做了研究，结果显示癌组织中自噬水平较癌旁组织低。本研究采用体外培养的方法，加入ABA作为干预因素，进一步探究自噬在肺癌细胞系Spc-A1中的作用及其可能机制。目的本研究以人肺腺癌细胞系Spc-A1为对象，加入不同浓度ABA进行干预，检测ABA作用后细胞活力的变化；将GFP-LC3质粒转染入Spc-A1中，加入ABA进行培养，用激光共聚焦显微镜观察不同处理浓度下细胞的自噬现象；分别从mRNA及蛋白水平检测对照组及各处理组Beclin-1及LC3-II的表达，明确ABA对Spc-A1自噬相关指标表达的影响；对实验结果进行统计学分析，探讨ABA对Spc-A1自噬的影响对肺癌新型治疗的意义。方法1.细胞培养将Spc-A1细胞培养于含10%胎牛血清的DF-12培养基中，37℃,5%CO2，每2-3天传代一次，保持细胞处于对数生长期。2. MTT法检测ABA作用下Spc-A1细胞活力收集对数生长期的Spc-A1细胞，调整细胞密度为5000~10000个/ml，种于96孔板中，待细胞贴壁后，加入ABA使培养浓度分别为进行培养，24小时后，加入MTT，用酶标仪检测各孔吸光值，根据吸光值计算出相对细胞活力。3.细胞转染及自噬观察取对数生长期的Spc-A1细胞传代至细胞培养皿，待细胞贴壁后按Lipofectamine2000说明书转染入GFP-LC3，6h后换正常培养基并加入浓度分别0.8μM、20μM、100μM的ABA，37℃、5%CO2培养箱中培养，24h后使用后激光共聚焦显微镜观察转染Spc-A1细胞的自噬情况。4.荧光实时定量PCR检测自噬相关基因表达分别抽取各处理组总RNA，将mRNA逆转录为cDNA后采用实时定量荧光PCR法分别检测Beclin-1及LC3-II基因水平表达的变化。5. Western-Blot检测自噬相关蛋白的表达分别抽取各处理组总蛋白，然后采用Western-Blot法分别检测Beclin-1及LC3-II基因水平表达的变化。6.统计学方法所有试验至少分3次独立完成，数据用x±s表示。多组间的差异用one-wayANOVA分析，两组之间的差异用t检验，统计在SPSS15.0软件统计包中进行，P＜0.05表示差异有显著性。结果1. ABA作用于Spc-A1细胞后细胞活力受到抑制Spc-A1细胞经浓度为0.8μM、20μM、100μM的ABA处理后，用MTT比色法，各处理组测得细胞活力相对百分比分别为：89.9%±2.4%，77.1%±0.5%，64.9%±2.8%，各处理组细胞活力与对照组差异具有显著性（P <0.001）。2. Spc-A1细胞在ABA的作用下自噬增多Spc-A1细胞转染入GFP-LC3质粒，经终浓度为0.8μM、20μM、100μM的ABA处理24h后观察，可见带有绿色点状荧光的LC3表达较未加入ABA处理的细胞显著增多，表明在ABA的作用下Spc-A1细胞的自噬增强。3. ABA作用后增加了Spc-A1细胞中Beclin-1及LC3-II mRNA的表达量Spc-A1细胞经终浓度为0.8μM、20μM、100μM的ABA处理后，提取细胞总RNA并反转为相应cDNA进行荧光实时定量PCR实验。结果显示：随着ABA浓度的升高，Beclin-1mRNA表达量升高，除了ABA0.8μM组与对照组之间表达量无差异外（P=0.636），其余各组两两之间表达差异均有显著性（P<0.001）；LC3-II mRNA表达量随ABA浓度的升高而升高，其中，各处理组表达量两两之间差异具有显著性，（ABA0.8μM组与对照组P=0.004，余各组两两之间P <0.001）。4. ABA作用后增加了Spc-A1细胞内Beclin-1及LC3-II的表达量Spc-A1细胞经浓度为0.8μM、20μM、100μM的ABA处理后，提取细胞总蛋白，用Western-blot法检测不同浓度ABA处理后Spc-A1细胞中Beclin-1以及LC3蛋白的表达量。结果显示： ABA100μM处理组与对照组Beclin-1表达量差异具有显著性（P=0.04），余处理组较对照组及处理组与处理组之间表达量未见显著性差异；ABA100μM处理组与对照组LC3-II表达量差异具有显著性（P=0.005），ABA0.8μM组与ABA100μM组之间表达量差异具有显著性（P=0.039）。余处理组表达量两两之间未见显著性差异。结论脱落酸可以促进调节自噬信号转导通路中相关基因Beclin-1以及LC3-II的表达，从而诱导肺腺癌细胞Spc-A1自噬，而且随着自噬的增加，可能导致细胞的死亡，抑制肿瘤的生长。