乳腺用于乳蛋白合成的主要源料是氨基酸,然而氨基酸营养并不是乳腺蛋白质营养的全部,血液循环中的小肽很可能参与了乳蛋白的合成。本研究利用奶牛乳腺组织/细胞体外培养模型,研究了不同的氨基酸配比和小肽对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成的影响(试验一)；小肽转运载体在乳腺上皮细胞中的表达调控及其在乳腺小肽摄取中的作用(试验二)；以及小肽促进乳蛋白合成的分子机制(试验三)。试验一不同的氨基酸配比和小肽对乳蛋白合成的影响本研究利用乳腺组织体外培养模型研究了必需氨基酸配比和小肽对乳蛋白合成的影响。首先,探索维持贴壁培养乳腺组织泌乳的条件,在乳腺组织培养液中分别添加不同浓度的催乳素、胰岛素、氢化可的松及其不同组合,检测激素对乳蛋白合成的影响。在此基础上,探讨苏氨酸(Thr)与苯丙氨酸(Phe)比例对乳蛋白合成的影响,进一步完善乳腺组织体外培养所需的氨基酸配比模式。然后,探讨Phe和赖氨酸(Lys)小肽数量及其氨基酸残基性质对乳蛋白合成的影响。结果表明,添加适宜浓度的泌乳相关激素能促进乳蛋白的合成,催乳素、胰岛素和氢化可的松的添加浓度分别为500 ng/mL、5000 ng/mL和1000 ng/mL时,αsl酪蛋白基因表达或乳蛋白合成显著增加(P<0.05)。改变培养液中Thr与Phe的比例能影响αsl酪蛋白基因表达和乳蛋白合成,当两者比例为1：1时,αsl酪蛋白基因表达丰度和培养液中乳蛋白含量最高。添加Phe和Lys小肽能影响乳蛋白的合成,不同的小肽添加比例及其氨基酸残基组成对乳蛋白合成有不同的影响。当Phe-Phe、Phe-Thr和Thr-Phe-Phe添加比例为10%,Lys-组氨酸(His)、Lys-Phe、Lys-Lys、Lys-亮氨酸(Leu)和Lys-Thr添加比例分别为15%、10%、5%、5%和5%时,αsl酪蛋白mRNA水平达到最高(P<0.05)。与由亲水性和带电荷的氨基酸残基组成的小肽相比,由疏水性和体积较大的氨基酸残基组成的小肽对乳蛋白合成的促进作用更大。以上结果表明,适宜的泌乳相关激素浓度和必需氨基酸比例能促进乳蛋白的合成；奶牛乳腺能摄取一定量的Phe和Lys小肽用于乳蛋白的合成,且其利用效率高于相应的氨基酸。试验二乳腺上皮细胞中小肽的摄取机理为揭示乳腺摄取小肽的分子机理,本研究应用实时荧光定量PCR、免疫组织化学和免疫细胞化学的方法研究小肽转运载体(PepT)在奶牛乳腺上皮细胞中的表达及其调控规律,探讨其在乳腺中的可能作用。并添加小肽转运载体功能抑制剂焦碳酸二乙酯(DEPC),检测小肽转运阻断对乳蛋白合成的影响,试图揭示小肽转运载体在乳腺小肽摄取过程中的作用。结果表明,奶牛乳腺组织中PepT2基因表达水平较高,在乳腺腺泡上皮细胞中能检测到PepT2蛋白表达,但没有检测到PepTl表达。PepT2基因表达受泌乳相关激素的调控,添加50ng/mL、500ng/mL和5000 ng/mL的催乳素、100 ng/mL氢化可的松及50 ng/mL、500 ng/mL、5000ng/mL和50000 ng/mL的胰岛素均可显著提高PepT2的mRNA丰度(P<0.05)。Phe小肽可以促进PepT2的基因表达,但其mRNA丰度并不随Phe小肽浓度的增加而无限提高。与对照组相比,添加5%和10%的Phe-Phe及5%、10%和15%的Thr-Phe-Phe均可显著提高PepT2的mRNA丰度(P<0.05)。当Phe-Thr添加比例为10%时,乳腺中PepT2的基因表达有增加的趋势(P=0.064)。比较三种不同的Phe小肽发现,小肽中的氨基酸残基不同,对PepT2的影响不同,Phe-Phe和Thr-Phe-Phe比等量的Phe-Thr对PepT2基因表达的促进作用更大(P<0.05)。10%Phe-Phe的添加显著增加了αsl酪蛋白和PepT2的mRNA丰度以及培养液中总蛋白含量(P<0.05),但对二肽水解酶DPEP2基因表达没有影响。而抑制PepT2转运功能(添加0.5 mM的DEPC)则降低了Phe-Phe对αsl酪蛋白基因表达和乳蛋白合成的促进作用(P<0.05)。以上结果提示,奶牛乳腺中有小肽转运载体2表达,且其表达受泌乳相关激素和底物小肽的调控；抑制PepT2转运功能降低了小肽对乳蛋白合成的促进作用,PepT2在乳腺小肽摄取过程中发挥积极作用。试验三小肽影响乳蛋白合成的分子机制的研究为探讨小肽在乳蛋白合成中的营养作用和调控作用,本研究检测了小肽对乳腺上皮细胞氨基酸摄取以及细胞膜上多种氨基酸转运载体基因表达的影响,并研究了不同Lys二肽对mTOR信号通路中三种信号因子(mTOR、4E-BP1和S6K1)基因表达的影响。结果发现,Phe-Phe的添加显著增加了αsl酪蛋白、ATB0+和y+CAT2的mRNA丰度以及培养液中Lys、Phe、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)的消失率(P<0.05)。Lys二肽替代Lys广泛促进了ATB0+的基因表达。除Lys-Phe二肽外,Lys-His、Lys-Leu、Lys-Thr和Lys-Lys的添加均提高了ATB0+的mRNA水平(P<0.01)。Lys-His和Lys-Lys均能显著提高mTOR、4E-BP1和S6K1的mRNA丰度(P<0.05)。这些结果说明,添加小肽能减少氨基酸之间的吸收竞争,促进乳腺对氨基酸的摄取；除作为底物促进乳腺氨基酸摄取和乳蛋白合成外,小肽也可作为信号分子参与乳蛋白合成。综上所述,适宜的泌乳相关激素浓度和必需氨基酸比例能诱导和维持体外培养的乳腺组织块中乳蛋白的合成,奶牛乳腺能摄取一定量的Phe和Lys小肽用于乳蛋白的合成,且其利用效率高于相应的氨基酸；奶牛乳腺中有PepT2基因和蛋白表达,PepT2在乳腺小肽摄取过程中发挥重要作用；小肽能减少氨基酸之间的吸收竞争、参与乳蛋白合成调控的信号通路,从而促进乳腺对氨基酸的摄取和乳蛋白的合成。