论文部分内容阅读
第一部分:45,XO特纳综合征患者血浆小RNA组学研究目的:筛选45,XO特纳综合征(TS)与正常46,XX女性差异表达的血浆microRNA(miRNA)材料与方法:收集10例未进行激素替代治疗的纯合45,X0病人血浆及10例月经周期正常的46,XX女性血浆。采用HiSeq 2000测序平台,对血浆中的小RNA进行测序。用Ingenuity Pathway Analysis软件进行生物信息学分析。对其中几种差异显著的高表达血浆miRNA,进行扩大样本量的real time quantitative PCR(qRT-PCR)验证。结果:共筛选到182种差异表达的miRNA,其中85种在45,XO组和46,XX组存在显著差异。生物信息学分析显示差异表达的miRNA,与特纳患者先天发育异常、生殖系统疾病、智力低下等异常临床表现密切相关。qRT-PCR结果进一步证实miR-320、miR-486-5p、let-7a-5p等miRNA在两组间存在显著差异。结论:小RNA组学分析显示45,XO患者较46,XX,血浆miRNA表达谱明显改变。这些改变的miRNA与45,XO异常临床表型密切相关,提示miRNA可能在其中有潜在作用。第二部分:特纳综合征差异表达的microRNA与X染色体逃逸失活基因关系研究目的:探索特纳综合征差异表达的microRNA与X染色体逃逸失活基因关系。材料与方法:检测核型为45,XO、46,XX、46,XY、47,XXY患者外周血单个核细胞(PMBC)miR-320a,miR-486-5p及逃逸失活基因 KDM5C,KDM6A,DDX3X的表达水平,探索其潜在的关联性。同时在核型为45,XO、46,XX流产胚胎性腺组织中验证。通过体外细胞实验,验证前面发现的microRNA与X染色体逃逸失活基因关系。结果:与血浆结果一致,miR-320a,miR-486-5p在45,XO的PMBC和流产胚胎性腺组织中高表达。通过45,XO、46,XX、46,XY、47,XXY四组比较,发现miR-320a,miR-486-5p与性染色体数目成负相关。同时在四组中验证了具有X/Y同源基因的KDM5C为逃逸失活基因,其在45,XO的PMBC和流产胚胎性腺组织中低表达,与miR-320a,miR-486-5p表达存在负相关。体外细胞实验,发现干扰KDM5C 后,miR-320a,miR-486-5p,miR-320a 的初始产物 pri-miR-320a 高表达,而miR-486-5p的初始产物pri-miR-486-5p没有改变,提示KDM5C能够负向调控miR-320a起始转录。而miR-320a过表达后KDM5C没有改变,提示miR-320a不能调控KDM5C表达。荧光素酶报告基因及ChIP实验,证实敲低作为转录抑制因子的H3K4me3去甲化酶KDM5C,可以解除其对编码miR-320a基因的启动子特定区段抑制作用,使该区域转录激活标志H3K4me3水平升高,miR-320a表达增加。结论:PMBC和流产胚胎性腺组织中,45,XO的miR-320a,miR-486-5p高表达,且与X染色体逃逸失活基因KDM5C水平呈负相关。敲低KDM5C后,能够通过增加miR-320a启动子特定区域H3K4me3的水平,反式激活miR-320a的转录。第三部分:X染色体基因调控的microRNA在特纳综合征先天性腺发育不全中作用研究目的:探索miR-320a及KDM5C在特纳综合征先天性腺发育不全中的作用。材料与方法:在原代培养的胎儿卵巢细胞(HFO)中,分别转染miR-320a的模拟物及KDM5C小干扰RNA,检测与卵巢发育相关因子的改变。同时通过荧光素酶报告基因验证软件预测的miR-320a靶点。结果:HFO细胞,分别转入miR-320a的模拟物及KDM5C小干扰RNA后,KITLG和BMP5的表达水平明显下降。转染miR-320a的抑制物后,KDM5C小干扰RNA对KITLG的抑制作用明显减弱。软件和荧光素酶报告基因证实KITLG是miR-320a的直接作用靶点。westerone blot实验发现45,XO的流产胎儿性腺组织的KITLG水平明显低于46,XX。结论:卵巢发育重要因子KITLG是miR-320a的直接作用靶点,上调的miR-320a及干扰KDM5C均可使其表达下调。其可能在特纳先天性性腺发育不全中发挥重要作用。