东北林蛙是我国一种珍稀的经济动物,雌性的输卵管会在冬眠期之前(每年的10月份)发生特异性的膨大,经历晾晒后形成林蛙油。林蛙油中作为一种功能食品,其中富含性类固醇激素成分,具有调节人体内分泌的功能。然而,林蛙油自身是否能够合成性类固醇激素迄今为止尚不清楚。本项研究以林蛙油—东北林蛙在冬眠前期的输卵管作为主要研究的对象,以繁殖期的输卵管为对照,检测两个时期的林蛙输卵管中胆固醇、孕激素以及孕激素合成相关因子的表达水平,为阐明林蛙油自身合成孕激素以及性类固醇激素在林蛙输卵管中的合成途径提供重要的科学理论依据。同时,该项研究结果也为今后可持续的深度开发林蛙油功能性食品奠定了一定的基础。本项目首先通过采用组织学的方法,观察冬眠前期和繁殖期的输卵管在组织形态方面的改变;通过无参转录组实验,检测两个时期的东北林蛙输卵管中差异基因富集情况;采用酶组织法,检测两个时期的东北林蛙输卵管中,性类固醇激素前体—胆固醇的含量;通过酶联免疫吸附实验,测定两个时期的东北林蛙输卵管中孕激素的含量;通过免疫组化实验、免疫印迹实验和Real Time PCR(RT-PCR)实验,研究了两个时期的东北林蛙输卵管中参与胆固醇转运的蛋白(St AR)、参与合成孕激素的反应的限速酶(P450scc)、调控类固醇激素合成的转录因子(SF-1),参与合成胆固醇的反应的限速酶(HMGCR)以及参与低密度脂蛋白摄取的受体(LDLR)的表达情况。本研究的主要成果如下所述:(1)组织学的结果表明,与繁殖期的东北林蛙输卵管相比,腺细胞在冬眠前期显著增大,而上皮细胞形态未发生显著改变。(2)在基因表达水平方面,无参转录组结果表明,在冬眠前期东北林蛙输卵管翻译过程以及类固醇激素合成途径显著高表达。Real Time PCR实验表明,在冬眠前期的输卵管中,HMGCR和LDLR的表达水平显著高于繁殖期,而St AR、P450scc和SF-1表达水平没有显示出显著性变化。(3)在代谢物水平方面,胆固醇测定结果表明,冬眠前期东北林蛙输卵管中游离胆固醇的含量为11.25±1.8μmol/g,显著低于繁殖期输卵管中游离胆固醇的含量(28.78±2.5μmol/g)。激素测定结果表明,冬眠前期东北林蛙输卵管中孕激素的浓度为0.782±0.044 ng/m L,显著低于繁殖期输卵管中孕激素的浓度(1.32±0.21 ng/m L)。(4)在蛋白表达水平方面,免疫组化的实验结果表明,两个时期的东北林蛙输卵管中均能够表达St AR、P450scc、SF-1、HMGCR和LDLR。免疫印迹实验结果表明,在冬眠前期,促进性类固醇激素合成的St AR和P450scc以及HMGCR、LDLR林蛙输卵管中的表达水平显著高于繁殖期,而调控性类固醇激素表达的转录因子SF-1的表达水平没有显示出显著差异。本项研究结果提示冬眠前期林蛙输卵管—林蛙油具有快速利用胆固醇合成孕激素的能力。该研究结果对特定人群如更年期和绝经期女性健康具有重要意义,为可持续开发和利用林蛙油功能性食品提供科学依据。