以早早孕试纸为代表的免疫层析快速检测技术具有廉价、即时、简便、自助操作等特点,不需要大型仪器和专业人员,可进行现场检测,十分适合快速获取中药成分的含量信息,从而实现中药采收、加工、生产、销售全过程的质量检测。本研究基于之前的结果,根据不同的检测需求,建立了多种基于不同技术策略的免疫层析试纸。目的:将免疫层析技术应用于中药质量控制,以柴胡皂苷D、葛根素、大黄酸等几种代表性成分为模式对象,建立针对中药指标性成分的免疫层析方法,实现自助、即时、快速检测中药中的有效成分,为开发新的中药质量控制及物质基础研究方法提供参考。方法:一、单克隆抗体(mabs)的生产与纯化采用本课题组前期工作中制备的阳性单克隆细胞株。冻存的杂交瘤细胞复苏后,接种于小鼠腹腔诱导其产生腹水,采集腹水,使用辛酸硫酸铵法从腹水中提取杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体,并用蛋白G柱纯化抗体,这些单克隆抗体即作为试纸特异性检测探针。二、制备柴胡皂苷D(SSD)胶体金免疫层析试纸1.不同粒径胶体金的制备与表征:采用柠檬酸氧化氯金酸法制备不同粒径胶体金,选择合适粒径作为抗体标记物。2.制备胶体金-抗体复合物:采用静电吸附法使标记物胶体金与单抗偶联,形成金标抗体复合物。3.考察胶体金标记抗体的最适pH及抗体标记量等条件。优化胶体金试纸条的制备工艺。4.根据优化后的条件,使用喷金划膜仪在NC膜喷上人工抗原SSD-BSA作为T线,与羊抗鼠二抗作为C线,结合垫上喷上金标抗体。依次将NC膜、吸水垫、结合垫、样品垫粘贴在聚氯乙烯(PVC)底板的相应位置,用试纸条裁剪机将组装好的试纸板切成试纸条。5.胶体金免疫层析试纸条方法学考察:包括试纸条的灵敏度,特异性,稳定性,重复性,与现有方法检测结果的相关性等,并用试纸检测多种复方中药制剂,测试实际检测效果。三、针对胶体金试纸灵敏度低,定量检测有局限等特点,选择灵敏度高,稳定性好的新型纳米材料量子点作为标记,以葛根素(PUE)为检测对象,制备量子点免疫层析试纸1.选择适合本实验的量子点及检测模式,对量子点性质进行表征2.量子点与抗体偶联:使用碳二亚胺法将标记物量子点与单抗共价结合形成复合物。3.对量子点免疫层析试纸条样品垫、标记垫、NC膜等部分的材料的及其前处理方式进行考察。优化量子点试纸条的制备工艺,包括缓冲溶液体系及表面活性剂、T/C线浓度等条件。4.按照优化后的条件,用喷金划膜仪在NC膜上喷上人工抗原PUE-BSA作为T线,羊抗鼠二抗作为C线,结合垫上喷上量子点-抗体复合物(QDs-IgG)并组装试纸条。5.量子点免疫层析试纸的方法学考察,包括试纸条的灵敏度,特异性,稳定性,重复性,加样回收率,与HPLC结果的相关性等,并用试纸检测多种复方中药制剂,测试实际检测效果。四、对量子点层析试纸做进一步改进,采用成本低廉,便于生产的IgY代替IgG,以大黄酸(RHE)为例,制备基于IgY的量子点免疫层析试纸1.IgY的生产与纯化:制备大黄酸人工免疫原,对雌性Roman鸡进行翅下免疫,收集鸡蛋,从蛋黄中提取纯化出IgY。2.考察IgY的效价及对RHE的灵敏度。3.量子点与IgY的偶联:使用碳二亚胺法使标记物量子点与IgY共价结合形成QDs-IgY复合物。4.试纸条的制备:优化IgY量子点试纸条的制备工艺,用喷金划膜仪在NC膜上喷上人工包被原RHE-OVA作为T线,羊抗鼠二抗作为C线,结合垫上喷上QDs-IgY,并组装试纸条。5.IgY量子点免疫层析试纸条方法学考察,包括试纸条的灵敏度,特异性,稳定性,重复性等指标。五、体内检测方法初探本节作为探索性研究,对QDs-IgG体内成像检测的可行性进行了初步试验。1.通过MTT法和绘制生长曲线对量子点的生物毒性进行考察。2.考察不同细胞对QDs的摄取行为,及量子点在细胞内的分布。3.考察QDs在整体动物、器官及组织中的分布特征。并考察QDs-IgG对中药成分体内检测的可行性。结果:一、成功制备了 SSD胶体金免疫层析试纸,建立了针对SSD的快速检测方法1.生产并纯化了特异性的PUE和SSD单克隆抗体,经过蛋白G柱纯化后,纯度达到90%以上。2.制备了不同粒径的胶体金溶液,通过紫外、电镜等手段鉴定了胶体金溶液。根据结果,选择粒径在22.3 nm左右的胶体金,建立了针对中药指标性成分SSD的胶体金免疫层析试纸。使用金标定量仪得到SSD胶体金试纸条线性回归方程为y =-0.1131n()+1.5451,R2=0.983。该曲线线性检测范围为 96ng/mL 到 150μg/mL,检测下限为96 ng/mL。方法学考察结果显示,该方法特异性好,性能稳定,可以应用于针对中药成分的定性定量检测。二、成功制备了 PUE量子点免疫层析试纸,建立了针对PUE的快速检测方法1.经过考察选择干式荧光法进行检测,并确定采用发射波长为605 nm QD2605的量子点作为标记物。2.以量子点为标记物制备了 QDs-IgG复合物,通过对层析试纸条各部件材料的筛选和处理,优化了量子点试纸条的制备工艺提高其抗干扰能力。选择合适材料与孔径样品垫、结合垫并适当增加样品垫的有效长度提高对样本的预处理能力。经过比较,结合垫采用Ahlstrom 8964、样品垫采用XQ-Y7,NC膜选择millpore 135s。采用以Tris-HCl为基质的高缓冲能力,高离子强度,高封闭蛋白缓冲体系对材料进行预处理。3.建立的量子点层析试纸的线性回归方程为y=-0.111n(x)+0.979,R2=0.9816,并且显示在1 ng/mL-10 μg/mL范围内具有良好的线性。检测限为5.8 ng/mL。4.对量子点免疫层析试纸条方法学考察结果显示,该试纸条特异性好,性能稳定,与液相结果的相关性较好,可以应用于复杂条件下(如中药复方)葛根素定性定量检测。三、成功制备了针对RHE的卵黄抗体IgY,开发了基于IgY的RHE量子点免疫层析试纸,建立了针对RHE的快速检测方法1.本实验制备了 RHE的人工抗原并对Roman鸡进行免疫,从鸡蛋黄中提取纯化出针对RHE的卵黄抗体IgY,用于后续实验。其ELISA回归方程为y =-0.0941n(x)+1.0224,R2 = 0.9944,线性范围为 5-3125 ng/mL。2.以量子点为标记物制备了 QDs-IgY复合物,使用量子点试纸检测仪得到试纸条线性回归方程为y=-0.1281n(x)+ 1.7627,R2 = 0.9792。该曲线线性检测范围为0.08-50μg/mL,检测下限为98.2 ng/mL。对该试纸的方法学考察结果显示,该试纸条特异性好,性能稳定,可以应用于针对中药成分的定性定量检测中。四、QDs-IgG应用于体内检测方法初探1.本实验显示QDs毒性很小,在体外检测试纸中应用很安全。2.本实验发现多种细胞均可摄取QDs,细胞摄取QDs的量与QDs的胞外浓度成正比,且摄取QDs后细胞仍可以进行有丝分裂。3.QDs在多种细胞系中均分布于细胞核附近内质网的位置。4.对QDs体内行为考察发现QDs会富集于淋巴结,而QDs标记单抗在体内的分布与QDs本身分布一致,不能反映出中药成分在体内的分布情况。结论:本研究将将免疫层析技术引入到中药检测领域,实验结果显示了免疫层析这种全新的技术手段在中药活性成分的含量测定方面具有重要意义和广阔的应用前景。本研究建立了定量胶体金免疫层析方法,实现了中药成分的大众化自助-即时检测,满足零散的中药检测需求。本研究首次将量子点免疫层析试纸应用于中药成分检测,以满足对于高灵敏度、精确定量检测的需求。并首次建立了针对中药成分的QDs-IgY免疫层析方法,以满足对廉价便捷检测的需求。此外,对量子点的毒性及其在整体、器官、组织及细胞内的分布行为进行考察,为进一步将其应用于体内外检测的深入研究奠定基础。综上,本实验建立的几种基于不同技术策略的免疫层析方法为即时-自助检测中药成分提供了有力的工具和全新的技术模式,并为开发新的中药质控方法提供参考。