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目的:揭示氧化型ATM在低氧三阴性乳腺癌干细胞(TNBC-CSCs)富集和干性维持中的作用及分子机制。方法:(1)流式细胞术对比分析常氧和低氧培养条件下,低氧对三阴性乳腺癌(TNBC)Hs578T和BT549细胞中CD44~+/CD24~-的干细胞样细胞的比例影响;乳腺癌干细胞微球体(mammospheres)形成实验对比分析常氧和低氧培养条件下,低氧对干细胞微球体形成能力的影响;qRT-PCR和Western blot检测富集得到的干细胞微球体CSCs标志物的表达情况。(2)Western blot检测常氧和低氧条件下干细胞微球体形成实验富集得到的干细胞微球体中ATM、p-ATM(s1981)和γH2AX(s139)蛋白表达量;qRT-PCR和Western blot分析ATM特异抑制剂KU60019处理、shRNA稳定敲低ATM表达,对TNBC-CSCs富集和干性标志物表达的影响。(3)2DG、二甲双胍分别或联合处理低氧TNBC-CSCs,应用ATM检测试剂盒检测ATP产量。ATM特异抑制剂KU60019处理或未处理低氧培养的TNBC-CSC微球体,分别用葡萄糖检测试剂盒、乳酸检测试剂盒、乙酰辅酶A含量测定试剂盒、柠檬酸含量测定试剂盒、α酮戊二酸测定试剂盒、琥珀酸测定试剂盒检测氧化型ATM活化与抑制的TNBC-CSCs的葡萄糖消耗量、丙酮酸生成量、乳酸生成量、乙酰辅酶A水平、柠檬酸水平、α-KG及琥珀酸形成;电镜观察TNBC-CSCs线粒体形态变化;线粒体膜电位检测试剂盒检测线粒体膜电位变化;以评价氧化型ATM活化与抑制,TNBC-CSCs能量代谢重塑(energy metabolism reprogramming,EMR)指标变化。(4)qRT-PCR和Western blot检测氧化型ATM活化与失活的低氧干细胞微球体代谢相关基因的表达;检测稳定敲低ATM和GLUT1对TNBC-CSCs富集及乙酰辅酶A水平的影响;分别用2-DG抑制糖酵解、UK5099抑制丙酮酸进入线粒体、BMS303141抑制胞质内柠檬酸生成乙酰辅酶A的关键代谢酶ACLY(ATP柠檬酸裂解酶)活性,检测TNBC-CSCs富集及乙酰辅酶A水平的改变;在微球体培养基中外源性添加乙酸盐或KU60019处理的同时添加乙酸盐,检测TNBC-CSCs细胞内乙酰辅酶A变化。(5)qRT-PCR和Western blot检测TNBC-CSCs干细胞微球体中氧化型ATM活化对SIRT1和USP13的表达影响;CO-IP实验确定SIRT1和USP13之间的相互作用。(6)Western blot和免疫荧光实验检测TNBC-CSCs微球体组蛋白H4乙酰化水平,明确氧化型ATM对TNBC-CSCs组蛋白H4乙酰化水平的维持作用;Western blot检测受氧化型ATM调控的糖酵解或/和SIRT1对组蛋白H4乙酰化水平和干性标志基因表达的影响。(7)裸鼠皮下成瘤实验明确氧化型ATM、氧化型ATM介导的EMR、氧化型ATM调控的乙酰辅酶A水平对TNBC-CSCs体内成瘤的影响;乙酰辅酶A含量测定试剂盒检测瘤体组织中的乙酰辅酶A含量;免疫组织化学染色检测GLUT1、HK2、SIRT1、H4ac和SOX2蛋白在瘤体中表达量。结果:(1)与常氧培养相比,低氧培养24h后,TNBC细胞Hs578T、BT549来源的CD44+/CD24-肿瘤干细胞比例明显增加;TNBC-CSCs干细胞微球体成球率显著提高;TNBC-CSCs干细胞相关标志基因(c-MYC、OCT4、KLF4和SOX2)的mRNA和蛋白表达水平均明显上调。(2)在常氧条件下,TNBC-CSCs微球体中存在一定量p-ATM(s1981)表达;与常氧培养获得TNBC-CSCs相比,低氧培养获得的TNBC-CSCs微球体球中p-ATM(s1981)表达显著增加,总ATM表达无明显变化,未检测到DNA双链损伤相关的标志蛋白γH2AX(s139)的表达。这些结果表明低氧有助于TNBC-CSCs富集和形成。氧化型ATM的特异抑制剂KU60019显著抑制TNBC-CSCs微球体的数量和大小,且呈计量效应关系。氧化型ATM抑制组TNBC-CSCs干性标志物的表达明显降低。(3)我们的研究首次揭示低氧TNBC-CSCs存在糖酵解与氧化磷酸化代谢异常。氧化型ATM维持TNBC-CSCs细胞的葡萄糖摄取和糖酵解过程,丙酮酸处于较高水平,但未检测到较高水平的乳酸生成;氧化型ATM的抑制,葡萄糖摄取减少,糖酵解中间产物(如丙酮酸)明显减低,但乳酸生成量无显著变化。低氧TNBC-CSCs中,来源于糖酵解的丙酮酸,进入线粒体被转化为柠檬酸,多数线粒体柠檬酸被转运到细胞质,用于生成胞浆乙酰辅酶A,少部分线粒体柠檬酸参与TCA循环。氧化型ATM具有维持TNBC-CSCs幼稚线粒体形态和膜电位的功能。氧化型ATM失活,TNBC-CSCs线粒体肿胀,线粒体膜电位明显降低。(4)氧化型ATM的活化,上调与葡萄糖吸收和糖酵解相关的GLUT1、HK2、PKM2表达、抑制丙酮酸向乳酸转化的LDHA,导致TNBC-CSCs独特的糖酵解能量代谢模式变化。敲低ATM或Glut1、使用2DG抑制糖酵解均显著减少TNBC-CSCs微球体的形成和细胞内乙酰辅酶A水平。氧化型ATM还维持丙酮酸脱氢酶PDHA的表达,催化进入线粒体内的丙酮酸向乙酰辅酶A转化。使用UK5099抑制丙酮酸转运进入线粒体,可明显减少TNBC-CSCs微球体的形成和细胞内乙酰辅酶A水平。(5)氧化型ATM变化虽不能改变SIRT1的mRNA水平,但能显著抑制SIRT1蛋白水平。氧化型ATM能抑制低氧TNBC-CSCs中USP13的表达。CO-IP实验证实USP13与SIRT1存在直接作用,使SIRT1去泛素化,进而维持SIRT1蛋白高表达。(6)Western Blot和免疫荧光染色实验的结果说明,氧化型ATM维持TNBC-CSCs中H4组蛋白乙酰化水平。氧化型ATM介导的糖酵解来源的乙酰辅酶A累积,对TNBC-CSCs中较高水平的组蛋白H4乙酰化起直接的调控作用,进而调控干性标志基因的表达。SIRT1对低氧TNBC-CSCs组蛋白乙酰化起负调控作用。氧化型ATM通过乙酰辅酶A与SIRT1共同调控TNBC-CSCs组蛋白H4乙酰化状态,并调控干性相关基因的表达。(7)裸鼠皮下成瘤实验揭示:氧化型ATM明显促进TNBC干细胞样细胞体内成瘤,维持瘤体组织内乙酰辅酶A含量,促进GLUT1、HK2、H4ac和SOX2蛋白在瘤体中表达,而抑制SIRT1表达。结论:(1)低氧促进TNBC-CSCs富集及干性标志基因的表达。(2)常氧培养的TNBC-CSCs中存在一定水平的氧化型ATM,低氧能显著激活ATM氧化活化,在TNBC-CSCs富集和干性维持中具有重要作用。(3)低氧TNBC-CSCs存在糖酵解与氧化磷酸化代谢异常。氧化型ATM明显促进低氧TNBC-CSCs糖吸收与糖酵解,促进线粒体柠檬酸向胞质的转运,维持低氧TNBC-CSCs线粒体形态和膜电位。(4)氧化型ATM调控糖代谢相关基因的表达,维持细胞内乙酰辅酶A水平,促进低氧TNBC-CSCs的富集。(5)低氧TNBC-CSCs中,SIRT1是USP13的直接作用底物。氧化型ATM通过USP13调控SIRT1的蛋白水平。(6)低氧TNBC-CSCs中,氧化型ATM通过乙酰辅酶A与SIRT1共同调控组蛋白H4乙酰化状态和干性相关基因的表达。(7)氧化型ATM-EMR-Acetyl-CoA/SIRT1信号轴促进TNBC-CSC样细胞体内成瘤。