输血常被用于急/慢性贫血治疗,在战、平时的生命救援中发挥着重要作用。而近年来临床用血急剧增加,天然血液来源相对有限。红细胞的保存条件苛刻,战争、自然灾害等特殊条件下红细胞的储运较困难。此外,输血前需进行交叉配型且输血过程中存在血源性疾病传播的风险,使得输血治疗面临较大挑战。红细胞代用品能够模拟天然红细胞的携-释氧功能,满足机体在失血条件下的供氧需求,逐渐受到广泛关注,成为了血液代用品领域的研究热点。红细胞代用品可分为两类:全氟化碳化合物（Perfluorocarbons,PFCs）及血红蛋白氧载体（Hemoglobin-Based Oxygen Carriers,HBOCs）。PFCs能够溶解大量氧气,因而具有良好的携氧能力。但其对氧气的输送是基于物理溶解,无法持续性供氧,生物利用度较低。血红蛋白（Hemoglobin,Hb）是红细胞发挥携氧功能的关键成分,HBOCs以血红蛋白作为其生物活性成分,其携氧行为更接近天然红细胞,即能够实现与氧气结合-解离的动态平衡,被认为是一种最有潜力的红细胞代用品。游离血红蛋白无法直接作为HBOCs发挥携氧/释氧功能。游离血红蛋白四聚体不稳定,分子粒径过小,直接输注后易通过肾小球滤过,造成肾衰和血红蛋白尿。其次,游离血红蛋白输注后易扩散至血管内皮层,结合血管舒张因子NO,引起血管活性。第一代HBOCs的研发旨在通过分子内交联、分子间聚合、高聚物修饰等修饰策略稳定血红蛋白四聚体结构,增大分子粒径,以提高其生物安全性,被统称为化学修饰类HBOCs。虽然化学修饰类HBOCs的研发开展得较早,技术相对较成熟,但临床试验中较多的毒副反应,如血管收缩、高血压、神经毒性及氧化损伤等,使得该类HBOCs进一步的发展应用受到限制,根本原因在于化学修饰类HBOCs无法克服血红蛋白裸露所引起的血管活性和氧化毒性问题。随着纳米载药技术的发展,基于微纳米结构的新型HBOCs逐渐成为研究焦点。以微纳米结构为基础的HBOCs主要包括微囊包裹血红蛋白和模板自组装血红蛋白。微囊包裹类HBOCs的制备理念是采用脂质体或合成高分子将血红蛋白封闭于纳米体系内。微囊屏障可避免血红蛋白与血液成分的接触,能够解决化学修饰类HBOCs因消耗血管舒张因子引发的血管收缩问题;也可减少网状内皮系统对其的捕获,延长循环时间。包裹工艺未涉及化学修饰,因此有利于维持血红蛋白的生物活性。微囊包裹血红蛋白的不足在于:一方面,包材对血红蛋白的负载主要是物理性的包裹,血红蛋白负载量较低。另一方面,脂质体包材的结构不稳定,存在脂质过氧化的问题,输注后易加剧机体氧化损伤。模板自组装类HBOCs通过无机模板与血红蛋白间的相互作用富集血红蛋白,可提高血红蛋白负载量,因而有望通过减少输注剂量以避免大剂量输注相关的副作用。并且可根据不同产品的设计需要,通过合理地筛选模板材料,灵活调控载血红蛋白粒子的粒径与形貌。模板自组装技术在构建载血红蛋白粒子方面具有诸多优势,在HBOCs领域展现出极大的发展潜力,但该类HBOCs缺乏表面保护屏障,戊二醛交联的稳定性低,及输注后氧化毒性是目前有待解决的重要问题。李峻柏基于层层自组装技术,以戊二醛为交联剂制备了载血红蛋白的空心微囊。由于戊二醛具有一定的生物毒性,此后该团队以二醛肝素替代戊二醛作为交联剂,以类似的方法制备了生物相容性更好的血红蛋白粒子。为了提高血红蛋白负载量,B（?）umler等以无机盐共沉淀的方法固载血红蛋白,该方法制得的粒子的血红蛋白浓度达天然红细胞的80%。由于对血红蛋白负载量高,模板自组装技术为通过减少粒子输注剂量,避免大剂量输注引发的副反应提供了可能。模板自组装技术在HBOCs的研发与应用方面具有广阔的前景,但血红蛋白结构与功能不稳定的问题亟需解决。首先,该类HBOCs缺乏表面保护屏障,血红蛋白暴露于周围组织与血液环境中,其渗漏后将引发游离血红蛋白相关的毒副反应,如血管收缩、高血压等。其次,该类HBOCs多以戊二醛在模板表面交联血红蛋白,戊二醛与血红蛋白间的亚胺键在溶液体系中易水解断裂,产生游离的血红蛋白和戊二醛,二者都将引起体内毒性。此外,由于缺乏天然红细胞所含有的还原酶,HBOCs制品中的血红蛋白自氧化加剧,输注后造成氧化毒性,加剧机体的氧化应激损伤。聚多巴胺（Polydopamine,PDA）具有超强的黏附特性与良好的抗氧化能力,因而为解决模板自组装类HBOCs所存在的上述问题提供了契机。聚多巴胺是一种新型功能高分子。在弱碱性条件下,多巴胺可自发聚合并稳定地黏附于基底介质表面,其组装出的黏附层可作为基底的保护屏障。因此,将聚多巴胺表面修饰与模板自组装技术相结合,有望克服现有的模板自组装类HBOCs血红蛋白裸露及交联不稳定的问题。聚多巴胺在聚合过程中存在失电子行为,因而能够结合自由基,发挥抗氧化作用。在本课题组之前的工作中,以一步装配法构建了聚多巴胺载血红蛋白纳米粒子（Hb-PDA NPs）,并在体外验证了其能够减弱血红蛋白的氧化毒性。Hb-PDA NPs的形成主要是基于聚多巴胺在单个血红蛋白分子表面的包裹,其不足在于:一方面,对血红蛋白的负载量偏低;另一方面,粒子的粒径过小,输注后易引起生物毒性。因此,将模板自组装技术与聚多巴胺表面修饰相结合,以无机盐共沉淀工艺提高血红蛋白负载量,增大粒子的粒径,避免因粒子粒径过小而引起的血管活性。聚多巴胺黏附层可作为粒子的表面保护屏障,避免血红蛋白裸露,减少血红蛋白渗漏,并且聚多巴胺的抗氧化特性有助于缓解血红蛋白的氧化毒性,为解决模板自组装类HBOCs稳定性不足的问题提供方法依据,使其更符合血液代用品的质控要求。为达成这一目标,需探讨如下几个问题:1.模板自组装技术与聚多巴胺表面修饰相结合,制备新型HBOCs的工艺的建立;2.新型HBOCs的携-释氧、抗氧化等生物学效能;3.新型HBOCs在静置保存及流场体系下的稳定性;4.新型HBOCs的生物安全性及在体分布代谢的特征。本研究包含以下四部分内容:第一章基于模板自组装技术的聚多巴胺包裹血红蛋白粒子的构建1.基于成球性、分散性、粒径分布及Hb包封率等性质,筛选了碳酸锰（Mn CO3）为本课题中Hb-PDA的制备模板。2.筛选了7.2mg/m L为共沉淀工艺负载Hb的最佳Hb投料浓度,Mn CO3共沉淀工艺的引入实现了对Hb的高负载,有利于粒子供氧效能的改善。3.建立了Hb-PDA的制备工艺,Hb-PDA为规整的球形粒子,平均粒径为840nm,激光共聚焦显微镜直观确认了粒子对Hb的包载,验证了Hb的化学结构得以维持。第二章聚多巴胺包裹血红蛋白粒子的生物相容性和生物学效能评价1.通过溶血实验、凝血实验及黏度实验验证了Hb-PDA具有较好的血液相容性。2.不同浓度的Hb-PDA处理HUVEC,细胞存活率均在98%以上,说明Hb-PDA的细胞毒性较低。Hb-PDA与RAW267.4共孵育3 h后,不会被迅速清除。3.PDA黏附层有助于改善游离Hb的携氧能力,可能与PDA聚合过程中消耗体系内溶解氧,PDA黏附层减少Hb渗漏及其自身的抗氧化特性有关。4.Hb-PDA最高可清除83.1±1.8%的羟自由基,为Trolox清除能力的85%。初步验证了Hb-PDA缓解过氧化氢介导的内皮细胞氧化损伤的效果。第三章聚多巴胺包裹血红蛋白粒子的稳定性研究1.Hb-PDA在4℃下保存两周,其平均粒径和多分散系数PDI未发生明显变化,未发生Hb突释。PDA作为保护层可有效减少游离Hb的产生,有利于减少游离Hb相关的毒副作用。2.Hb-PDA在200、400 S-1的剪切率下粒径变化较小;高于800S-1时不同剪切时间对应的粒径开始发生统计学差异（P<0.05）,推测是高剪切力下粒子与小室壁面的接触频率增多,从而影响粒子的形态和尺寸。Hb-PDA在不同剪切力作下的Hb渗漏率均不超过5%,说明Hb-PDA可耐受剪切力,避免Hb大量释放。3.基于表面元素分析,推断PDA与Hb之间基于酚羟基的结合是提高粒子稳定性的结构基础。第四章聚多巴胺包裹血红蛋白粒子的体内评价1.Hb-PDA可复苏失血性休克的大鼠,相比生理盐水能更持久性地维持血压,能够恢复机体酸碱平衡状态。氧化应激因子的测定结果提示Hb-PDA可在体发挥抗氧化作用。2.输注后粒子在肺中的聚集最多,可能是由于Hb-Mn CO3-PDA粒径较大（800nm）,易附着于肺泡表面的毛细血管内壁面。粒子在肝、肺中的含量于输注后第12 h达到峰值,但在12-24 h急剧下降,说明大量的粒子在此时间段内经肝脏代谢、清除;聚集于肺中的粒子可重新回到血液循环,有利于延长滞留时间。初步揭示了粒子可通过单核巨噬系统清除。3.粒子输注后未造成白细胞计数及各类白细胞占比的异常改变,各个生化指标未发生异常改变,仅在肾组织中观察到轻度的病变,说明粒子具有较低的体内毒性。综上所述,本文基于模板共组装技术有利于提高Hb负载量,调控粒子粒径;PDA的黏附特性有助于避免Hb裸露、减少Hb渗漏,其抗氧化特性有利于缓解Hb的氧化毒性,提出了将PDA表面修饰与模板共组装技术相结合制备新型HBOCs（Hb-PDA）。本文确定了Hb-PDA的工艺路线,明确了Hb-PDA的理化特征,验证了Hb与PDA的负载。Hb-PDA具有较好的生物相容性,供氧效能较游离Hb有所提高,且能够发挥抗氧化作用,在静置保存和剪切流动的条件下均未发生Hb突释且维持了粒径稳定性。体内评价验证了Hb-PDA能够发挥扩容与复苏的效果,不引起血液免疫毒性和明显的脏器损伤,并具有较长的循环时间。本课题的研究发现有利于推动聚多巴胺作为一种新型HBOCs修饰平台的研发应用,为以聚多巴胺表面修饰提高HBOCs稳定性,构建更符合HBOCs质控标准的产品提供了方法依据。