微小RNA(microRNA,miRNA)是一类广泛存在于动植物、微生物体内,长度在21-24nt的单链非编码RNA。miRNA在生物体内参与基因转录后调控,通过对mRNA切割和翻译抑制两种方式抑制基因的表达和蛋白质生产,从而参与调控包括生长、发育、凋亡、生殖和信号传导等生物学过程。miRNA不仅在细胞内发挥调控作用,还能分泌到胞外,进入循环系统,这些miRNA被称为“循环miRNA”。多项研究证明,在人体血清、唾液、乳汁、尿液中均检测到循环miRNA。循环miRNA主要通过外泌体运输、转运蛋白及细胞破碎释放的方式进入循环系统中,其中以外泌体途径为主。循环miRNA作为细胞间交流信号分子,被装载进入外泌体,从合成位置运输到靶器官或靶细胞中发挥调控基因表达的作用。miRNA能够跨物种调控基因表达。2012年张辰宇教授团队发现水稻中miR168a能穿过小鼠肠道进入血液循环系统,通过微泡运输到达肝脏,抑制肝脏中低密度脂蛋白受体衔接蛋白基因(LDLRAP1)的表达,从而调节胆固醇水平。2017年该团队还发现花粉中的miR162a通过下调蜜蜂中amTOR基因的表达,使幼蜂倾向发育为工蜂。2015年,课题组利用Illumina高通量测序的方法在家蚕体内检测到8种桑源miRNA。在此基础上,本研究利用寡食性昆虫家蚕和桑树这对组合为研究对象,分析了桑树miRNA在家蚕消化道中的稳定性。以此为切入点,选择能够耐受家蚕消化酶的桑树miRNA,利用生物信息学的方法预测桑源miRNA在家蚕中的靶基因,进一步通过mimic miRNA转染家蚕细胞系、双荧光素酶报告实验、体外家蚕器官培养、mimic miRNA注射家蚕、饲喂mimic等策略探究桑源miRNA是否能调控家蚕靶基因的表达。获得主要结果如下:1.桑源mi RNA在家蚕肠道中的稳定性分析提取家蚕消化液处理后的桑叶总RNA,通过琼脂糖凝胶电泳和荧光定量PCR检测RNA的含量,发现大部分RNA发生降解,说明桑叶中提取的裸RNA对家蚕消化液敏感。随后,在桑叶匀浆中加入家蚕消化液,提取上清液中RNA进行检测分析。与对照组相比,大部分长片段RNA被降解,而miRNA的降解程度较低,与对照组无显著差异,说明桑叶miRNA通过某种方式被保护起来,避免了家蚕消化酶对其的降解。其中miR166b、miR396b的含量有所增加,推测家蚕消化酶加速了这些miRNA从桑叶细胞中的释放。2.桑源mi RNA在家蚕血淋巴外泌体中的检测分离出家蚕血淋巴中的外泌体,通过荧光定量PCR检测发现,桑源mi RNA被装载进入家蚕外泌体。值得注意的是,在桑树叶片中表达量较高的miR159a在家蚕血淋巴微泡中相对含量较低,而叶片中表达量较低的miR396b却在家蚕血淋巴外泌体中丰度较高,说明家蚕可能通过外泌体的方式选择性地转运桑叶miRNA进入体内,发挥调控家蚕体内基因表达的作用。3.桑源mi RNA在家蚕中的靶基因预测分析参考课题组前期研究结果,通过miRanda和RNA22软件预测了在家蚕中检测得到的8个桑源miRNA(miR156c、miR159a、mi R162、miR166b、miR166c、miR167e、miR396b、miR398)的靶基因。分别预测得到1757个(miRanda)和1320个(RNA22)靶基因,两个软件共同预测到247个靶基因。为了减少预测得到靶基因假阳性率,进一步提高miRanda和RNA22的预测条件,共同预测得到58个靶基因,GO功能分析发现这些靶基因参与了家蚕的多个生理过程。4.桑源mi RNA对家蚕中候选靶基因表达变化分析选择14个家蚕候选靶基因,借助家蚕器官培养和注射实验完成了初步基因表达变化分析。在此基础上,选择了4个家蚕靶基因(APO、CCAP、DnaJ和RAD50)进入深入验证。将miR396b mimic和miR156c mimic转染到家蚕BmN和BmE细胞系后,通过荧光定量PCR检测靶基因的表达水平,发现APO、CCAP、DnaJ和RAD50基因的表达水平均有所下调。再者,连有DnaJ和RAD50部分序列的荧光素酶报告基因与miR396b mimic共转染细胞,其荧光素酶活性降低。进一步将mi R396 mimic添加到饲料后饲养家蚕,通过荧光定量PCR检测发现miR396b mimic能进入家蚕血淋巴中,并且家蚕DnaJ和RAD50基因的表达水平均显著下降。综上,通过以上实验证明了家蚕DnaJ和RAD50基因可能是桑源miR396b的靶基因。