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研究背景与目的：子宫肌瘤是女性生殖器最常见的良性肿瘤，多见于30-50岁的妇女,发病率占20-30%，有报道40-50岁妇女子宫肌瘤发病率高达51.2%-60％。其主要症状包括异常子宫出血、盆腔受压引起下腹部不适、肌瘤变性或扭转引起疼痛等，严重时甚至可致流产或不孕等，严重威胁广大女性的身心健康。子宫肌瘤虽为良性肿瘤，但也有少数可发生恶变（0.13％～1.39％），加之其居高不下的发病率，年轻化的发病趋势，对整个医疗体系及社会的长远发展造成了很大的影响。目前对于其发病机制尚不明确，若能对发病机理有新的认识可为其治疗提供新的思路。目前普遍认为子宫肌瘤是雌、孕激素依赖性的良性肿瘤，药物治疗主要通过拮抗雌、孕激素及其受体的表达。在课题组前期实验中，我们发现在子宫肌瘤中miR-26a显著低表达的（P<0.05），对ERɑ、PRa起调控作用，所以我们猜测是否miR-26a在子宫肌瘤中对ERɑ、PRa的调节失控，促使ERɑ、PRa的表达增加，从而增加子宫平滑肌瘤细胞对雌、孕激素的敏感性增加而促进肌瘤的生长？再者miR-26a在子宫肌瘤中低表达是否是因其上游的启动子调控区CpG位点发生甲基化而引起的？基于前期实验结果、miR-26a研究现状及立题思路，我们试图通过研究miR-26a的表达对雌、孕激素生物学效应的影响，从细胞水平上进一步探讨miR-26a在子宫平滑肌瘤发病中的作用，以及通过对miR-26a上游启动子调控区CpG位点的甲基化分析进一步深入探讨子宫平滑肌瘤的发病机制，以期能为子宫平滑肌瘤的的靶向治疗提供新的思路。研究方法：我们通过Ⅰ型胶原酶消化、筛网过滤分离法成功分离培养了子宫平滑肌瘤细胞，并对所获得的细胞根据化学免疫进行纯度鉴定。原代培养的细胞，通过脂质体转染miR-26a的mimic及miR-26a的inhibitor分别使其高表达和低表达，或加入雌、孕激素受体拮抗剂，从而得基础分组（Blank组、NC mimic组、miR-26a mimic组、miR-26a inhibitor组、ERɑ拮抗剂组、PRa拮抗剂组），之后每组分别加入雌激素或孕激素，培养48h后进行CCK-8增殖检测，检测雌、孕激素与其受体抑制的增殖作用以及miR-26a高、低表达时加入雌、孕激素后的增殖作用，从而验证miR-26a在子宫平滑肌瘤细胞中对雌、孕激素敏感性的影响，以从细胞水平上进一步探讨miR-26a在子宫肌瘤中的作用。用软件分析miR-26a上游的的启动子452碱基序列，发现该序列中有潜在4个甲基化位点（30位点、99位点、283位点、406位点），用BSP测序法（即结合重亚硫酸盐测序法）检测miR-26a基因启动子4个CpG位点的甲基化频率。首先通过收集子宫肌瘤组织及瘤旁的正常肌层组织6例，进行基因组DNA的提取，用重亚硫酸盐处理基因组DNA，对修饰后的CpG进行PCR扩增，后对PCR产物进行TA克隆，每个组织对应的DNA选取10个转化子进行测序，并与参考序列进行对比，即可确定所研究的CpG位点的甲基化频率，共12个组织，挑取120个克隆，测序120个反应，从而确定了4个位点的CpG甲基化频率。实验结果：通过Ⅰ型胶原酶单次消化法成功培养子宫平滑肌瘤细胞，其成功率达89%。并根据细胞的免疫化学染色的方法对所获得的子宫平滑肌瘤细胞中肌动蛋白的表达进行检测鉴定，得到细胞的纯度在96%以上。我们将带羧基荧光素的NC mimic转染细胞后，发现细胞的转染效率在75%以上。实验结果显示，细胞转染miR-26a mimic组增殖速度显著慢于对照组(P<0.05)，抑制细胞增殖，且其抑制作用与单独加入雌激素受体拮抗剂或孕激素受体拮抗剂相当，加入雌激素、孕激素后，miR-26a mimic组抑制增殖作用未明显增强；而转染miR-26ainhibitor组与对照组相比细胞增殖快（P<0.05），再加入雌、孕激素后其增殖作用较前明显增强(P<0.05)，说明低表达miR-26a可以增强子宫平滑肌瘤细胞对雌、孕激素的敏感性，从而促进细胞增殖。BSP克隆测序法检测结果显示，重亚硫酸盐的转化效率在98%以上，子宫平滑肌瘤与正常肌层样本中总体甲基化状态差异不明显（甲基化频率分别为63.67%±13.21，64.58%±10.54）；miR-26a上游启动子序列的四个CG位点（30位点、99位点、283位点、406位点）在子宫平滑肌瘤与正常肌层中的甲基化频率分别为73.33%±23.38，58.33%±24.83；68.33%±14.72，56.67%±19.66；70%±8.94，70%±12.65；51.67%±7.53，73.33%±16.33），其中406位点在子宫平滑肌瘤组织中的甲基化频率明显低于正常肌层组织（P<0.05）。结论：本实验通过胶原酶单次消化法高效获得了原代培养的子宫平滑肌瘤细胞，可为子宫肌瘤体外实验研究提供细胞模型；miR-26a低表达能增加子宫平滑肌瘤细胞对雌、孕激素的敏感性，而促进子宫肌瘤的发生，这可能是通过miR-26a调控ERα、PRa的表达来实现的,说明miR-26在子宫平滑肌瘤发病中起重要作用；子宫平滑肌瘤中miR-26a上游启动子调控区30位点、99位点、283位点的甲基化与发生子宫平滑肌瘤无明显相关性，而第406碱基的CpG位点的低甲基化与子宫平滑肌瘤的发生有关，这可为子宫平滑肌瘤的发病机制的研究提供新思路。