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D型流感病毒是新定义的流感病毒家族的一员,于2011年首次从疑似患流感的猪体内分离获得,自2014年以来在世界各地的牛体内被发现,其主要宿主包括猪、牛和其他小反刍动物等。此外血清学证据也证明了D型流感病毒具有感染人类的可能性。同时该病毒也被认为与牛的呼吸道疾病有着密切的关系。HEF蛋白是D型流感病毒表面唯一的糖蛋白,决定其感染特性。因此对D型流感病毒基因特性以及HEF蛋白免疫原性的研究为预防D型流感病毒起到了重要作用。本研究首次尝试构建了D型流感病毒的反向遗传操作平台,并且利用昆虫细胞杆状病毒系统构建了可以作为D型流感病毒有效诊断抗原的HEF蛋白重组杆状病毒,并利用DNA免疫小鼠获得了抗HEF蛋白血清。实验主要分为两大部分,第一部分是:应用A型流感病毒的十三质粒反向遗传系统的pHH21和pCAGGS载体,通过分子克隆等手段构建了D型流感病毒的十二质粒反向遗传操作平台;同时依据广泛应用于A型流感病毒的八质粒反向遗传系统的pBD载体,构建了D型流感病毒的七质粒反向遗传系统。分别将两套系统的重组质粒通过共转染到293T细胞中,并将质粒转染的293T细胞上清液对细胞以及豚鼠进行感染,通过Real-time RT-PCR方法以及电镜观察对拯救病毒进行鉴定。第二部分是:首先利用杆状病毒载体构建了重组HEF蛋白的杆状病毒系统,通过红细胞凝集试验以及Western Blotting试验鉴定HEF蛋白的免疫原性。同时应用pCAGGS载体构建了用于小鼠DNA免疫的高效表达HEF蛋白的重组质粒,并通过与CpG-ODN分子佐剂进行联合免疫获得了相应的抗HEF蛋白血清,并通过血凝抑制试验进行抗体效价的检测。研究结果:(1)成功地构建了D型流感病毒的十二和七质粒反向遗传系统;(2)通过七质粒反向遗传系统共转染293T细胞成功获得特异性病毒粒子;(3)拯救的病毒不能够感染A549、MDCK、ST细胞,可在豚鼠的上呼吸道中进行少量的复制拷贝,但感染效力较低;(4)成功地构建了可以作为D型流感病毒诊断抗原的重组杆状病毒;(5)通过质粒与CpG-ODN分子佐剂联合免疫小鼠制备了具有较高血凝抑制效价的抗HEF蛋白血清。