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头颈部肿瘤是指发生在鼻腔、口腔、喉和食管上部的肿瘤。90%以上的头颈部肿瘤是头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCCs)[1,2]。全世界每年大约有50万人被诊断为HNSCCs,在美国每年3万人被诊断为HNSCCs,占所有癌症病例的3%左右[3,4]；中国每年头颈部肿瘤的年发病率为15.22/10万,占全身恶性肿瘤的4.45%[5]。HNSCCs是5年生存率最低的恶性肿瘤之一,且过去几十年没有明显改善。然而迄今为止,人们对HNSCCs调控发生与发展的分子机制还不十分清楚,阻碍了头颈部鳞状细胞癌的有效治疗。因此寻找有效抑制头颈部鳞状细胞癌的相关信号转导通路具有重要性和必要性。真核细胞中内质网(Endoplasmic Reticulum, ER)是主要的细胞器,是翻译和修饰蛋白折叠的加工厂。在生理和病理条件下干扰内质网功能并引起未折叠蛋白和错误折叠蛋白在内质网腔中的蓄积,造成内质网应激(ER stress),细胞通过激活信号转导通路引起的未折叠蛋白蓄积发生反应,称为未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。内质网表面有三个应激传感器,分别是肌醇需酶-1(Inositol-requiring enzyme1, IRE1)、激活转录因子-6(Activating transcription factor6, ATF6)、核糖核酸依赖的蛋白激酶样内质网激酶(Protein kinase RNA (PKR)-like ER kinase, PERK)。当内质网处于应激状态时,UPR可激活这三个转录因子,引起未折叠的和错误折叠的蛋白在内质网内沉积降解。如果过度的未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网中未被降解,慢性或持续性内质网应激可导致细胞凋亡。细胞处理内质网应激的能力对细胞生存起决定作用。研究者普遍认为大多数肿瘤由于肿瘤细胞快速增殖,相对缺乏血液供应在其微小环境中是处于应激状态。我们设想头颈部鳞状细胞癌已经长期处于内质网应激状态,通过加入小分子化合物处理使其内质网应激反应增强,导致凋亡从而达到治疗目的；而正常组织通过常态UPR缓解内质网应激。传统中药材雷公藤中的南蛇藤素具有抗肿瘤活性。为探讨南蛇藤素抗肿瘤的分子机制,本研究以人头颈部鳞状癌细胞系作为研究对象,探讨南蛇藤素诱导头颈部鳞状细胞癌细胞未折叠蛋白反应以及引起癌细胞凋亡的分子机制,为中药治疗头颈部肿瘤和其他肿瘤提供理论依据。实验方法1.免疫组化法检测人的颈部、喉、下唇中肿瘤组织和正常组织Bip的表达情况。2.通过ATP依赖的荧光素酶细胞活性检测系统,研究南蛇藤素对多种头颈部鳞状细胞癌细胞的生长抑制情况。3.将带有荧光素报告基因CHOP的头颈部鳞状癌细胞SCC23皮下接种到Nu/Nu SCID小鼠中,给予南蛇藤素治疗,观察南蛇藤素对肿瘤的生长抑制作用。4.实时定量RT-PCR检测与CHOP凋亡相关基因NOXA, PUMA,TRB3和GADD34在南蛇藤素治疗后的多种头颈部鳞状细胞癌的表达情况。5. Caspase-Glo(?)3/7Assay Systems检测Caspase酶蛋白的表达情况,Western Blot法检测Pro-Caspase9和cleaved Caspase3在多种头颈部癌细胞的表达情况,DNA ladder检测细胞凋亡情况。6. Western Blot法检测Ub蛋白在多种细胞系给予南蛇藤素后的表达情况,以及南蛇藤素对26s糜蛋白酶体的抑制情况。7. Steady-GloTM荧光素酶检测系统,研究南蛇藤素作用于转染CHOP基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-CHOP),观察该细胞PERK通路中CHOP的表达。同时南蛇藤素作用于转染XBP1基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-XBP1),观察该细胞IRE1/XBP1通路中XBPls的表达情况。RT-PCR检测XBP1的剪切情况。8.ATP依赖的荧光素酶细胞活性检测系统和Western Blot,检测给予南蛇藤素后,PERK,eIF2a, ATF4,CHOP的野生型和敲除型小鼠胚胎成纤维细胞系中,细胞存活率、未折叠反应相关蛋白和凋亡相关蛋白表达情况。实验结果1.免疫组化结果显示颈部、喉和下唇中肿瘤组织Bip的表达明显高于正常组织。提示头颈鳞状细胞癌中Bip可能是头颈部肿瘤的一个相关生物标记物。2.ATP依赖的荧光素酶细胞活性检测,结果表明,南蛇藤素对多种头颈部鳞状癌细胞生长有抑制作用。3.体内实验证明,南蛇藤素治疗后肿瘤体积明显缩小,治疗第27天肿瘤的抑瘤率为73.77%,对实体肿瘤SCC23有生长抑制作用。4.用qRT-PCR检测结果表明,与CHOP相关的凋亡基因NOXA, PUMA, TRB3和GADD34经南蛇藤素治疗后,在多种头颈部鳞状细胞癌的表达高于未给药组。DNA ladder结果表明,经南蛇藤素治疗后,细胞出现凋亡。结果提示,南蛇藤素是通过凋亡来抑制头颈部鳞状细胞癌细胞生长。5. Caspase-Glo(?)3/7Assay Systems检测结果表明,给予南蛇藤素组Caspase比值表达明显高于未给药组。Western Blot检测到cleavedCaspase3在头颈部鳞状细胞癌细胞系中的表达随着治疗时间的增加而增强。6. Western Blot结果显示,经南蛇藤素治疗后,细胞内泛素化蛋白的表达增高。说明南蛇藤素可引起泛素化蛋白堆积,但是南蛇藤素对26s糜蛋白酶体的活性没有影响。7. Steady-GloTM荧光素酶系统结果表明,用南蛇藤素处理CHO-CHOP细胞,该细胞的PERK通路中CHOP的表达显高于未给药组,同时南蛇藤素处理CHO-XBP1细胞,该细胞的IRE1/XBP1通路中XBPls的表达明显高于未给药组。结果表明,南蛇藤素增强了内质网应激。RT-PCR可以看出随着南蛇藤素剂量的增加,被剪切后的XBPls也随着增加,结果表明,南蛇藤素可能通过促进内质网应激来调节细胞的存活。8.ATP依赖的荧光素酶细胞活性检测系统,检测给予南蛇藤素后,PERK,eIF2a, ATF4,CHOP的野生型和敲除型小鼠胚胎成纤维细胞系的存活率,结果表明,南蛇藤素对野生型细胞的存活率明显低于对基因缺陷型细胞的存活率。Western Blot结果表明,野生型细胞中未折叠反应蛋白和凋亡相关蛋白的表达高于基因缺陷型细胞。证明南蛇藤素是通过内质网应激介导的细胞凋亡途径促进细胞凋亡。结论本研究证明南蛇藤素是通过增加错误折叠蛋白导致其内质网应激/UPR反应,从而引起头颈部鳞状细胞癌细胞凋亡。本研究结果,为南蛇藤素治疗头颈部肿瘤和其它肿瘤提供了理论依据。头颈部鳞状癌细胞中Bip的表达高于正常细胞,Bip可能是头颈部鳞状细胞癌一个潜在生物标记物。