研究背景呼吸系统主要行使通气和换气功能,对维持人体的正常生命活动非常重要,呼吸系统的完整性依赖于其自身的先天免疫系统,它可保护人体免受各种微生物的感染并且对炎症反应有调节作用。在受到外界因素损伤后,呼吸系统上皮细胞会大量死亡并诱发炎症反应,从而导致肺部组织大规模的损伤,常导致各种急性和慢性的肺部疾病。这些疾病在进展到一定程度后,由于炎症和肺上皮层渗漏,经常反复发生感染,进一步会导致不可逆的肺纤维化进展。1986年,PJ Cole教授提出了著名的“恶性循环”理论来阐述支气管扩张和慢性阻塞性肺病的病理生理过程,该理论指出外界因素引起肺组织损伤,损伤的上皮细胞更容易被细菌感染,而反复感染可导致慢性炎症和更多的组织损伤,这样恶性循环最终会导致肺功能明显下降,甚至死亡。鉴于呼吸道感染已成为人类死亡的主要原因,且耐抗生素病例不断增加,增强宿主防御将成为一种极具临床潜力的策略。组织再生作为肺损伤的一种辅助治疗方法引起了广泛关注。正常的成人肺组织在受到伤害或刺激后可激活一群特殊的肺成体干细胞并通过再生过程修复受损肺组织。目前发现,有一群特殊的内源性肺干/祖细胞在维持肺的稳态和再生方面起到重要作用。其中,已有研究发现表达基底细胞限制性转录因子P63和角蛋白5的远端气道干细胞/祖细胞（DASCs）在肺损伤后具有强大的再生能力。流感性肺损伤可激活DASCs,并使其大量增殖并迁移至损伤区域通过再生修复损伤的肺组织,而且DASCs可以分化成为成熟的上皮细胞。因此,大量的体外扩增能力和移植后显著的肺整合能力使DASC成为肺疾病治疗的理想选择。抗微生物多肽（AMPs）是由动物、细菌和植物产生的多肽类物质,被认为是自然界的广谱抗生素,其是先天免疫的重要组成部分,具有广谱的抗微生物活性,包括细菌、病毒、真菌和寄生虫等。LL37是目前发现的唯一存在于人类体内的抗微生物多肽,已知其通过直接靶向微生物生物膜和刺激先天免疫细胞功能参与多种宿主防御过程。在肺炎患者肺组织中,LL37表达升高并且具有强大的抗感染和抗炎能力,提示LL37可作为常规抗生素的替代品来治疗肺部感染。然而,由于蛋白酶对LL37的作用,使其在体内的半衰期较短而限制了其在临床中的应用。此外,为了避免潜在的毒性,LL37需要在局部发挥作用而不是全身性的给药。因此,开发一种能够实现局部、长期释放LL37的方法对于肺部感染的治疗是非常必要的。呼吸系统受到外界有害物质损伤后会对病毒和细菌等微生物更加易感,最终恶性循环导致肺功能的丧失甚至死亡。因此将组织修复（DASC）和抗微生物（LL37）结合起来的新策略将成为呼吸系统复杂疾病的理想选择。目的1.观察小鼠源性DASCs（mDASCs）对小鼠博来霉素（BLM）肺损伤后的保护作用;2.观察抗微生物多肽LL-37对铜绿假单胞菌（PAO1）的抗菌作用并研究其相关作用机制;3.通过BLM肺损伤合并肺感染验证“恶性循环”理论,然后通过慢病毒转染技术使mDASCs表达LL37并观察LL37转染对细增殖、整合和分化能力的影响,进一步观察LL37-mDASCs的体外和体内抗菌作用以及对小鼠肺功能的影响;4.通过慢病毒转染技术使人源性DASCs（hDASCs）过表达LL37并将其移植到脱细胞化的大鼠肺中观察LL37-hDASCs的抗菌作用。方法1.分离、培养mDASCs,通过气管滴注BLM（3U/g）制作小鼠肺损伤模型,并在BLM损伤后7天通过气管移植mDASCs（1*10⁶）,并在移植细胞7天和14天后通过体视显微镜观察干细胞在肺内的分布及整合;通过免疫荧光染色观察细胞在肺内的增殖,分化;通过HE和Masson染色观察mDASCs对BLM肺损伤的影响;测定肺羟脯胺酸含量并通过蛋白质印记法和免疫荧光染色检测肺内α-SMA表达的变化;通过检测小鼠动脉血O2饱和度、O2分压和CO2分压观察mDASCs对BLM肺损伤小鼠肺功能的影响;观察mDASCs对BLM肺损伤小鼠死亡率的影响。2.将不同浓度的人工合成抗微生物多肽LL37（80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、50μg/ml和2.5μg/ml）和PAO1（1*10⁵ CFUs/ml）共培养12h,或将10μg/ml的LL37分别和1*10⁵ CFUs/ml及1*10⁶ CFUs/ml的PAO1共培养4h、4h、12h和24h,在波长595nm处测量OD值,观察其抗菌作用;将大鼠肺泡巨噬细胞NR8383给予脂多糖（LPS）刺激,Control组给予正常培养液培养12h,LPS组给予含1μg/mL LPS的培养液培养12 h,LL37组给予含10μg/ml LL37的培养液培养12 h,LPS+LL37组在1μg/mL LPS刺激的基础上,同时加入10μg/ml LL37培养12 h,LPS+LL37+anti-LL37组在上组基础上加入10μg/ml的LL37中和抗体。用CCK-8法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,酶联免疫吸附法检测细胞上清液肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的分泌水平,用蛋白质印迹法检测细胞P-NF-κΒp65蛋白表达水平。3.通过慢病毒转染使mDASCs表达LL37;通过细胞增殖实验观察LL37转染对细胞的影响;通过体视荧光显微镜观察比较mDASCs和LL37-mDASCs在肺内的整合;通过免疫荧光染色观察比较较mDASCs和LL37-mDASCs在肺内的增殖和分化;通过PCR、蛋白质印迹法和免疫荧光染色观察LL37的表达;将mDASCs和LL37-mDASCs的细胞（1*10⁶）或细胞上清同1*10⁴CFUs的PAO1或者大肠杆菌（E.coli）共培养16h,并测定波长595nm处测量OD值或菌落计数观察LL37-mDASCs的抗菌作用;气管滴注BLM（3U/g）制作小鼠肺损伤模型7天后通过气管将30ul含有5*10⁶CFUs的PAO1或E.coli的菌液和标记了GFP的mDASCs或LL37-mDASCs（1*10⁶）通过气管滴入小鼠肺内,2天后取有荧光的肺叶并检测肺泡灌洗液（BALF）及肺组织匀浆中菌荷量;通过HE染色观察LL37-mDASCs对BLM损伤及感染的影响;通过对CD68分子免疫组织化学染色,观察BLM损伤及肺感染后LL37-mDASCs对肺内免疫细胞的影响;通过检测动脉血O₂饱和度、O₂分压和CO₂分压观察LL37-mDASCs对BLM损伤及肺感染后小鼠肺功能的影响。4.通过慢病毒转染使hDASCs过表达LL37;通过PCR、蛋白质印迹法和免疫荧光染色观察LL37的表达;制备脱细胞化大鼠肺,并将hDASCs和LL37-hDASCs移植入脱细胞化肺内,体式荧光显微镜下观察移植情况;将有细胞定植的肺叶和PAO1或E.coli（2*10⁴CFUs）在24孔板（500μl）中共培养16h,在波长595nm处测量OD值,观察其抗菌作用。结果1.BLM损伤后7天后肺内会出现内源性的mDASCs并且具有增殖活性;将mDASC移植到BLM损伤的小鼠的肺内,发现mDASC可以在肺内定植,并随着时间延长可以在肺内形成肺泡样结构并且表达AECI的标志物AQP5、PDPN和HOPX;通过组织病理学改变及评分发现mDASC移植可以明显改善肺组织的损伤;此外,mDASCs可以降低肺内胶原的沉淀,抑制成纤维细胞的形成,改善小鼠肺功能,降低死亡率。2.LL37可以对铜绿假单胞菌有直接抑制作用,并且其抗菌能力具有浓度依赖性和时间依赖性;LL37可以减轻LPS导致的NR8383细胞活性下降和凋亡;LL37可以有效抑制LPS诱导的NR8383细胞促炎症因子的分泌;LL37可以抑制LPS导致的NR8383细胞P-NF-κΒp65蛋白的表达。3.小鼠肺在BLM损伤后对细菌感染的清除能力下降并且损伤更加严重;LL37转染对细胞的增殖、定植和分化能力没有影响;体外实验中,表达LL37的mDASC对PAO1或E.coli具有抑制作用,并且这种抗菌作用可以被LL37的中和抗体所抑制;体内实验中,LL37-mDASCs可以降低BALF和肺组织匀浆中的菌荷量,改善肺组织的损伤,明显减少肺组织内免疫细胞的浸润,改善损伤后小鼠的肺功能。4.LL37-hDASC可在脱细胞化的大鼠肺内定植并表达LL37;体外实验中,过表达LL37的hDASC对PAO1或E.coli具有抑制作用。结论1.mDASCs小鼠BLM性肺损伤具有保护作用;2.LL-37对PAO1具有直接抗菌作用并对LPS诱导的NR8383细胞损伤有保护作用,其机制可能和下调NF-κB信号通路,从而抑制炎性因子的产生有关。3.小鼠肺在BLM损伤后对细菌感染的清除能力下降并且损伤更加严重,LL37-mDASCs具有对PAO1或E.coli具有抑制作用,可以减轻BLM损伤及肺感染并改善肺功能。4.LL37-hDASCs对PAO1或E.coli具有抑制作用。