水稻白叶枯病菌中趋化性基因che的表达调控及其功能研究

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环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)是一种参与细菌信号转导的小分子第二信使,调控了生物膜、胞外多糖形成、运动性、毒性等许多生理功能。水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)全局性转录调控因子Clpxoo作为一种重要的受体蛋白,其cNMP结构域可与c-di-GMP结合、并发生蛋白构象的改变,而其DNA结合结构域与下游靶基因启动子相结合、调控基因的表达。Clpxoo介导的c-di-GMP信号调控机制参与Xoo多种重要的生理生化过程,对毒性表达起着非常重要的作用。本研究选取了受Clpxoo蛋白正调控的趋化性基因che(PXO00043)为靶基因,深入探索che基因表达的调控机制及其在Xoo毒性中的功能。取得以下主要研究结果:1.利用5’RACE(rapid-amplification of cDNA ends)法,鉴定了che基因转录启始位点,利用含有GFP报告基因的pPROBE-AT载体,构建了che基因启动子活性检测系统,通过荧光显微镜和流式细胞仪的检测,明确了che基因启动子的活性,发现Clpxoo蛋白是激活che基因所必需的。此外,虽然che基因在XOM2培养基中上调表达,但并不显著受转录调控蛋白HrpX和HrpG的影响。2.分别构建了Clpxoo蛋白第70位天冬氨酸位点D70、第99位谷氨酸E99和第166位精氨酸R166位点的点突变,并进行了表达和纯化。利用结合等温滴定实验(ITC),检测了点突变体与c-di-GMP的结合能力。发现R166突变成丙氨酸R166A后,蛋白发生严重降解和稳定性降低的现象;D70突变成丙氨酸D70A后,点突变体完全丧失了与c-di-GMP结合的能力;E99突变成丝氨酸E99S后,点突变体与c-di-GMP结合能力大大减弱。因此,Clpxoo蛋白D70和E99是与c-di-GMP结合的关键氨基酸位点。3.构建了受Clpxoo蛋白调控的趋化性基因che的缺失突变体及其互补菌株,检测了它们对水稻的致病表型。发现che基因缺失影响了Xoo致病性,互补菌株能恢复。表明che基因与Xoo毒性有关。总之,本研究确定了趋化性基因che的转录起始位点,鉴定了启动子活性;明确了Clpxoo蛋白对che基因表达的调控作用;阐明了D70和E99是Clpxoo与c-di-GMP结合的两个关键功能位点;发现了趋化性基因che影响了Xoo致病性。
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