昆虫作为最大的动物类群,在地球上已经生存繁衍了4亿多年。超强的繁殖能力是亿万年里昆虫为适应诸多生态环境的变化,并保持种群兴盛所进化出的重要“绝技”之一。而该项技能与雌性昆虫个体独特的卵巢管结构和复杂的卵子发生过程紧密相关。对影响雌性昆虫卵子发生过程的关键基因进行鉴定,进而解析其调控机制,可以更好地实现对昆虫繁殖的人为调控,从而为害虫防治和品种改良提供有效的分子靶标。昆虫卵黄原蛋白受体(Vitellogenin receptor,VgR)作为卵母细胞吸收卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vg)等营养物质的关键分子,在卵母细胞成熟和胚胎发育中发挥着重要作用。近年相关研究表明,在多种卵生动物物种中,VgR的结构和功能均高度保守。VgR不仅能够通过胞吞作用介导Vg进入卵巢,还可能将一些血淋巴蛋白运输到卵巢;另有研究表明,VgR可以参与病毒在昆虫中的垂直传播。有关鳞翅目模式生物及重要的经济昆虫家蚕的VgR及Vg的研究已经持了数十年。2012年林英等人在首次报道了家蚕卵黄原蛋白受体(BmVgR)的全长基因序列,并证明了BmVgR能通过胞吞作用介导家蚕卵黄原蛋白(BmVg)进入卵巢,且BmVgR的突变会导致家蚕隐性同质型胚胎致死的白妙卵突变体(vit)的产生。而目前对于昆虫VgR表达调控方面的研究,除在双翅目的埃及伊蚊(Aedes aegypti)和膜翅目的红火蚁(Solenopsis invicta)中有少量报道外,有关转录后或翻译水平调控机制的研究几乎仍是一片空白。因此,探究雌性繁殖关键基因VgR的调控机制,将为利用VgR实现精细地调控昆虫繁殖过程提供可靠手段。本研究以家蚕为研究对象,探究了家蚕BmVgR的表达调控机制。首先,利用小RNA测序鉴定卵巢管中小RNA的种类和丰度;紧接着利用双荧光素酶报告系统、miRNAs的转染以及转基因等方法对作用于BmVgR转录后水平或翻译水平调控的miRNAs进行鉴定;随后,为探究鉴定的miRNAs与BmVgR转录调控过程是否存在关联,开展了BmVgR的转录调控研究;最后通过启动子克隆分析对在转录水平上影响BmVgR表达的关键转录因子进行鉴定,并对其与miRNAs的关系进行分析,从而完善了BmVgR表达调控网络。获得的主要研究结果如下:1.家蚕卵巢内小RNA的鉴定昆虫的卵巢管由处在不同发育时期并呈“串珠”状排列的卵泡组织所构成,是研究基因表达调控的理想模型。以家蚕的卵巢管作为研究模型,选取处于卵黄发生期(Vitellogenesis)和卵壳形成期(choriogenesis)的卵泡组织进行小RNA建库测序分析。从两个不同时期卵泡组织测序文库中分别测序获得了13143251和16743213条clean reads,其中长度在18-30nt的小RNA分别为999665和999551条。比较不同长度的小RNA的reads数发现,两个文库中均主要存在两个峰,其中一个位于21-22 nt,为经典miRNAs成熟体的长度;而另一个位于27-28 nt,与经典的piRNAs(PIWI-interacting RNAs)成熟体的长度相符。这表明处于正在发育过程的卵巢管中存在着大量的miRNAs和piRNAs,且从卵黄发生期到卵壳形成期miRNAs的总量是升高的,而piRNAs的总量是降低的。而Western blot结果表明BmVgR蛋白的合成从卵黄发生期到卵壳形成期呈现下调趋势,与miRNAs总量的表达趋势呈负相关。进一步分析显示,从两个小RNA文库中分别鉴定到383个已知的miRNAs和257个新的miRNAs,且在两个文库存在差异表达的miRNAs有242个。这些结果为miRNAs在卵子发生过程中的表达调控研究提供了重要的数据支撑,也为后续探究miRNAs对BmVgR的表达调控打下了坚实的基础。2.靶向BmVgR的miRNAs鉴定及验证miRNAs一般作用于基因的3端非编码区(3’UTR)。因此在克隆得到BmVgR基因的3’UTR的序列后,以卵巢管中鉴定到的640个miRNAs为预测miRNAs库,利用在线网站TargetScan预测发现BmVgR 3’UTR上存在112个miRNAs的结合位点。将这112个miRNAs同测序分析中存在差异表达的242个miRNAs取交集,得到27个miRNAs。随后进一步利用qRT-PCR验证,发现其中10个miRNAs从卵黄发生期到卵壳形成期上调表达,其表达模式与BmVgR呈负相关,具有靶向BmVgR的明显特征。利用双荧光素酶报告系统和合成的miRNAs类似物进一步对这10个miRNAs进行验证,结果发现bmo-miR-2739和novel-miR-167能显著抑制BmVgR 3’UTR上游荧光素酶的活性,说明bmo-miR-2739和novel-miR-167可能通过作用于BmVgR 3’UTR参与BmVgR的表达调控。在家蚕卵巢细胞系(BmN4-SID1)中,利用合成的miRNA类似物和抑制剂成功对bmo-miR-2739和novel-miR-167实现了过表达和抑制。qRT-PCR和western blot结果表明BmVgR在mRNA和蛋白水平上出现对应的下调和上调表达,但蛋白水平的变化程度比mRNA水平更加强烈,暗示这两个miRNAs可能更多的参与了BmVgR的翻译抑制过程。利用位点突变及双荧光素酶实验,我们在HEK293T细胞和果蝇的S2细胞中,都证明了在BmVgR 3’UTR上存在3个bmo-miR-2739的结合位点和1个novel-miR-167的结合位点。表明bmo-miR-2739和novel-miR-167是通过与BmVgR 3’UTR结合来发挥调控作用。同时发现在抑制细胞内源的bmo-miR-2739和novel-miR-167后,细胞内吞BmVg的能力增强。在化蛹第2天和第4天分别注射miRNA抑制剂(miRNA antagomir)后,卵巢管内bmo-miR-2739和novel-miR-167分别被下调了48.2%和28.6%,卵内BmVgR和BmVn蛋白较对照组均出现了增加,然而BmVgR mRNA是下降的。这也间接说明这两个miRNAs可能更多的是参与BmVgR的翻译抑制过程,但具体是在mRNA降解还是翻译抑制方面发挥作用还需要更深入的研究。总之,bmo-miR-2739和novel-miR-167通过结合到BmVgR 3’UTR上的结合位点调控BmVgR的合成。3.BmVgR与bmo-miR-2739和novel-miR-167的表达相关性分析时空表达模式的分析有助于进一步明确miRNA对靶基因的调控模式。qRT-PCR和Western blot结果显示,在卵巢组织中,BmVgR mRNA从上蔟第2天(W2D)开始增加,到第3天(W3D)的达到最高水平;BmVgR蛋白在化蛹第3天(P3D)和第4天(P4D)均有较高的表达。bmo-miR-2739和novel-miR-167均在蛹期阶段少量表达而幼虫阶段高量表达,与BmVgR蛋白的合成基本呈现负相关。在不同发育时期的卵巢管中,novel-miR-167的表达早于bmo-miR-2739达到峰值,暗示其先发挥对BmVgR蛋白合成的抑制作用,而随着bmo-miR-2739表达量的增加,两者协同完成对BmVgR蛋白合成的精细调控。在家蚕上蔟2天的不同组织的中,均可以检测到了BmVgR mRNA,且在卵巢中表达量最高,而western blot结果显示仅能在卵巢中检测到BmVgR蛋白的合成。有趣的是,bmo-miR-2739在卵巢中表达量较高,而novel-miR-167在非卵巢组织中高量表达。结合时空表达模式分析及前期功能验证结果表明novel-miR-167辅助bmo-miR-2739完成BmVgR在卵巢内的时期特异性合成调控;而novel-miR-167还负责抑制BmVgR在非卵巢组织中的合成。4.bmo-miR-2739和novel-miR-167转基因过表达品系的构建及分析为了在个体水平上对bmo-miR-2739和novel-miR-167的功能进行分析,我们利用piggyBac系统构建并获得了bmo-miR-2739和novel-miR-167的转基因过表达品系(U6-2739和U6-n167)。qRT-PCR检测结果表明在两个过表达品系的蛹6天的卵巢组织中,这两个miRNAs分别被上调2.1倍和1.8倍。有趣的是在U6-2739品系中novel-miR-167的表达也出现了上调,而在U6-n167品系中bmo-miR-2739的表达也同样出现了上调,暗示两个miRNAs之间存在某种相互促进的机制。进一步观察发现过表达品系个体的卵巢管发育较对照组迟缓;且卵泡组织周围出现了BmVg的聚集,卵母细胞内卵黄磷蛋白(BmVn)较正常组少,且卵偏小。对转基因过表达品系的血淋巴进行Western blot检测发现BmVg较对照组增多,而卵内BmVn和BmVgR蛋白则较对照组减少,说明由于miRNA的过表达导致卵内BmVgR合成下降,从而使运输进卵内的BmVg变少,造成了BmVg在卵泡外及血淋巴中的囤积现象。对产卵后的转基因品系蚕蛾进行解剖发现,其体内依然存在着许多尚未发育完全的卵,致使其产卵率低于对照组。将两个miRNA过表达品系杂交后筛选同时过表达bmo-miR-2739和novel-miR-167的个体,结果发现同时过表达这两个miRNAs的雌性个体的蛹较正常组偏大,但蛹体内卵的发育受阻,有些个体内部甚至几乎没有卵的形成。而在发育严重迟缓的卵内的bmo-miR-2739和novel-miR-167分别被上调了4.8倍和51.0倍,与单一过表达品系相比,上调倍数明显增高,暗示这两个miRNAs之间确实存在某种相互促进作用;另外,Western blot结果显示卵内BmVgR蛋白和BmVn蛋白也明显少于对照组。这些现象表明这两个miRNAs的超表达显著地抑制BmVgR的合成,从而导致卵巢管内卵泡发育迟缓甚至无法形成。5.转录因子POU-M2和BrC通过应答蜕皮激素共同参与BmVgR的转录调控目前miRNAs调控BmVgR的表达主要通过翻译抑制和mRNA降解,而是否会影响BmVgR转录水平的表达,目前尚不清楚,因此需先探究清楚调控BmVgR转录的关键因子。对体外培养的卵巢组织进行激素处理后发现蜕皮激素(20E)能够诱导BmVgR的转录,而保幼激素(JH)对BmVgR的表达没有明显的影响。紧接着我们成功克隆得到了BmVgR基因ATG上游2.5 kb的序列作为潜在的BmVgR启动子序列。预测该启动子的转录起始位点位于ATG上游57个碱基处,TATA box位于-80~-88。比较发现POU-domian元件(VVL)的数目是预测到的59种元件中最多的。同时我们自NCBI基因组数据库中下载到来自3种不同目的5种昆虫VgR的启动子序列,预测发现这在所有昆虫的VgR启动子上均存在大量的POU-domain元件VVL,其中尤以鳞翅目中为最多。随后利用双荧光素酶报告系统,EMSA,ChIP-PCR等实验证明了家蚕POU结构域转录因子POU-M2能够结合到BmVgR启动子上并在上蔟期启动BmVgR高量表达。由于POU转录因子在昆虫乃至脊椎动物中的高度保守性,推测POU家族转录因子也可能在昆虫VgR基因的调控过程中发挥重要作用。此外,BmVgR启动子上也预测到多个早期应答20E的结合元件BrC,E74等。通过细胞共转实验发现,单独转染BrC-Z1/Z2/Z4对BmVgR启动子活性没有明显的影响,但当BrC-Z1/Z2/Z4分别与POU-M2同时存在时,原本由POU-M2引起的增强作用变得更加显著。通过双荧光素酶报告实验及EMSA发现BrC-Z1能够与POU-M2的启动子结合并增强其表达。因此结合早期研究发现20E通过诱导BrCZ1/Z2/Z4的表达,进而激活POU-M2的表达,而POU-M2与BrC-Z2等一些转录因子结合并共同启动BmVgR在上蔟期的高量表达。综上所述,我们发现bmo-miR-2739和novel-miR-167通过直接结合到BmVgR3’UTR上参与其组织和时期特异性的表达,从而使得BmVgR蛋白在卵巢的卵黄发生期特异地合成。而在BmVgR蛋白合成以前,20E通过作用于POU-M2和BrC在上蔟期启动BmVgR mRNA的高表达,随后mRNA被运送到卵母细胞,接受由bmo-miR-2739和novel-miR-167指导的BmVgR蛋白的合成,保证卵母细胞正常的吸收BmVg蛋白并发育成熟以及后续成功的胚胎发育。本研究鉴定了家蚕繁殖过程中重要的营养运输受体BmVgR在转录后水平上关键的调控因子bmo-miR-2739和novel-miR-167,以及在转录调控过程中的关键基因POU-M2和BrC,有助于进一步的利用这些因子实现精细的人为调控家蚕的繁殖过程,为害虫防治和品种改良提供有效的分子靶标。