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类风湿性关节炎(RA)是一种以致残性多关节滑膜炎为特征的常见的慢性自身免疫性疾病,关节滑膜表面的成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)在RA的长期病程中起关键作用,可以早期参与并触发自身免疫应答,通过分泌趋化因子、促炎因子、促进NO合成等参与炎症反应,可以通过降解细胞外基质和介导破骨细胞形成来破坏关节结构,并且FLS可以维持自身过度增殖,生长特性类似于局限性侵袭性生长的肿瘤细胞,诱导RA滑膜细胞凋亡可为发展新的RA治疗药物提供一种新途径。TRAIL (Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)发现于1995年,是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员。TRAIL能够诱导多数肿瘤细胞凋亡,而对大多数正常细胞无毒性,因而被广泛用于癌症治疗研究。此外,我们实验室前期研究中获得了小鼠抗人DR5(死亡受体5)的单克隆抗体AD5-10,在无交联剂的情况下,能引起多种肿瘤细胞凋亡。提示我们TRAIL和AD5-10有可能通过诱导FLS凋亡成为潜在的类风湿关节炎治疗药物。本论文研究了TRAIL和AD5-10联合表阿霉素对类风湿性关炎的治疗作用及其机制。从类风湿关节炎病人膝关节置换术后关节切除物分离FLS细胞,用不同浓度TRAIL或AD5-10和不同浓度表阿霉素(Epirubicin, EPB)联合处理FLS, MTT法测定细胞存活率,发现单独使用TRAIL或AD5-10时,细胞存活率无变化;而在同时加入不同浓度化疗药物表阿霉素EPB时,FLS细胞死亡的能力大大加强,且呈浓度依赖性。说明表阿霉素和TRAIL或AD5-10联用对FLS的杀伤具协同作用。我们进一步研究了细胞内部信号通路分子的变化。研究发现,当单独使用TRAIL或AD5-10时,caspase级联通路分子没有发生明显的变化,而当与表阿霉素连用时,pro-caspase-3、8、9都发生了明显的剪切,提示联用使FLS发生了凋亡。此外,表阿霉素处理可使FLS细胞表面死亡受体DR4、DR5的表达上调,凋亡抑制蛋白c-FLIP、Bcl-2水平下降,细胞周期蛋白P21水平下调,P53表达水平上调,提示这可能是表阿霉素协同TRAIL或AD5-10诱导FLS凋亡的分子机制。在这些工作的基础上,我们进一步探讨了将AAV-TRAIL应用于类风湿关节炎治疗的可行性。通过体外研究发现rAAV2/5比rAAV2/2侵染FLS的效率更高,而表阿霉素可显著增强rAAV2/5在FLS中介导的外源基因表达。在rAAV2/5-eGFP侵染后的FLS中加入50ng/ml、200ng/ml、1000ng/ml EPB可使荧光强度分别从11.0%提高到26.8%、84.9%、90.5%。而用rAAV2/5-TRAIL侵染FLS 4h后,加入浓度为50ng/ml、200 ng/ml的EPB时,培养上清中TRAIL含量从57.59±3.67μg/ml上升到228.77±34.80μg/ml、511.91±19.56μg/ml。综上,本研究发现EPB可以上调死亡受体DR4、DR5,下调凋亡抑制蛋白c-FLIP,Bcl-2,细胞周期抑制蛋白P21,增强FLS对TRAIL和AD5-10的敏感性。同时EPB可以增加AAV2/5介导的外源基因TRAIL的表达,即EPB可以通过两种机制增强rAAV2/5-TRAIL对FLS的凋亡诱导活性,从而为RA治疗提供了新的策略。