一、研究背景蟾毒灵（bufalin）是来源于我国中药蟾酥的一种化合物,其相对分子质量为386.5,分子式为C₃₄H₃₄O₄,,熔点为238²44℃,不易溶于水。现代药理研究表明,蟾毒灵有多种药理作用,主要表现在强心作用、抗肿瘤作用、麻醉镇痛作用以及增加免疫等方面,并在临床应用中已经取得了满意的疗效。然而临床上经常有因服用过量或服用方法不当发生中毒的报道,而其毒性研究目前尚不完善。如何避免毒性反应同时充分发挥蟾毒灵的有效性是亟待解决的课题。研究中药提取物蟾毒灵的药理和毒性作用的机制,对指导基础研究和临床研究有十分重要的意义。细胞凋亡在心脏发育过程中至关重要,长期以来与许多心血管疾病有关,如缺血性心脏病,再灌注损伤,化疗引起的心肌病和心力衰竭。同时,心肌细胞凋亡可以导致心肌功能异常,包括心肌梗死,终末期心力衰竭,致心律失常性右心室发育不良和阿霉素诱导的心肌病。诱导细胞凋亡的诱因往往是通过激活一个或多个信号转导通路来实现的,这些通路会激活天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶家族,称为半胱天冬酶。半胱氨酸蛋白酶表达为无活性的酶原并且通过二聚化或特异性蛋白水解切割响应凋亡刺激而被激活。活化的半胱氨酸蛋白酶切割并激活其他家族成员以及几种关键蛋白质,使细胞分解。半胱天冬酶活化作为细胞凋亡的中心环节,可以通过三种不同的机制启动:死亡受体途径,线粒体途径和内质网应激。而药物引起的心脏毒性不排除存在细胞凋亡的可能。内质网是负责蛋白质折叠和装配,脂质和甾醇生物合成以及游离钙储存的细胞器。然而,在生理或病理条件下,如ER处理蛋白质的能力受限,Ca²⁺剥夺可诱导未折叠和错误折叠的蛋白质的积累可导致内质网应激。在内质网应激反应过程中中,细胞内会发生未折叠蛋白反应（UPR）,以保持内质网的稳态。UPR的一个主要途径是ER分子伴侣的上调,例如葡萄糖调节的蛋白质78kDa（GRP78）,其可以有助于修复未折叠的蛋白质。适度的ERS可以缓解细胞功能障碍,增加生存的可能性,而过度和持久的ERS导致细胞凋亡。Caspase-12在内质网应激期间被性激活,在内质网应激诱导的细胞凋亡反应中,内质网应激诱导的caspase-12激活会进一步触发caspase-3的激活,最终引发细胞凋亡。二、研究目的改进原代心肌细胞提取技术,缩短实验时间,提高细胞纯度;通过观察不同浓度蟾毒灵对SD大鼠乳鼠原代心肌细胞的搏动频率、凋亡以及内质网应激相关指标的影响,探讨蟾毒灵引起心肌细胞毒性的机制。三、研究方法1、取新生2至3日SD大鼠乳鼠在无菌环境下取其心脏,经消化液消化以及差速贴壁后得到原代心肌细胞,经细胞观察和鉴定后确定细胞性质,经细胞计数确定细胞纯度,获得的细胞用作之后的实验。2、将低、中、高浓度的蟾毒灵加入到心肌细胞中,观察加药前后搏动次数的改变。3、Hochest33258染色观察细胞变化和Caspase-3检测确定加药后的原代心肌细胞是否存在细胞凋亡。4.用蛋白印迹法（Western-blot）来检测内质网应激诱发凋亡的相关指标CHOP、Caspase-12、Caspase-3以及GRP78的蛋白表达结果。四、研究结果1、调整了原代心肌细胞提取的技术,将实验时间缩短至三小时左右（国外本实验一般需过夜）,细胞纯度一般可达到70%以上,可满足实验需求。2、加入药品蟾毒灵后,镜下视野中标记四个位置进行跳动计数,加药后相同区域的细胞簇跳动次数明显加快。提示蟾毒灵可明显提高原代心肌细胞的跳动频率,且具有时间依赖性和浓度依赖性。3、经Hochest33258染色,观察细胞出现核染色质致密,染色加深,细胞体积缩小,胞质较致密、嗜酸性染色增强,可观察到凋亡小体,提示原代心肌细胞可能存在凋亡;经过caspase-3检测,发现caspase-3表达增加,提示原代心肌细胞可能存在凋亡。综合二者,蟾毒灵可诱发原代心肌细胞凋亡,其凋亡具有浓度依赖性。4、经过Western-blot检测,发现内质网应激诱导凋亡的相关因子CHOP、Caspase-12以及GRP78随蟾毒灵浓度增加表达皆有增强的趋势,提示蟾毒灵诱发心肌细胞凋亡可能与发生内质网应激有关。五、研究结论1.原代心肌细胞提取中,采用分步消化的方法比隔夜消化更为简便省时,细胞纯度无明显差异;差速贴壁20min至30min即可去除大多数成纤维细胞,而使活性较强的心肌细胞保留下来,得到细胞纯度优于差速贴壁1小时以上。2.蟾毒灵可明显抑制心肌细胞的活性,即具有细胞毒性;蟾毒灵可以诱导心肌细胞凋亡,且其诱导凋亡的作用具有浓度依赖;蟾毒灵诱导细胞凋亡可能是通过引起钙离子超载刺激细胞发生未折叠蛋白反应,从而诱发内质网应激,引起细胞凋亡。