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聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)抑制剂是通过合成致死机制,治疗同源重组修复缺陷肿瘤的一类药物。目前,已经有四个PARP抑制剂相继上市应用于晚期卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌的治疗,标志着PARP作为抗肿瘤靶点和协同致死理论在临床得到确认。然而,PARP抑制剂在产生良好治疗效果的同时,其对同源重组修复缺陷肿瘤应用的局限性和耐药的产生都阻碍了其在临床的进一步发展。为了拓宽PARP抑制剂的应用范围并克服其在临床应用过程中产生的耐药现象。本课题采用高通量的方法对PARP抑制剂与99个抗肿瘤药物的联合效应进行了检测,并筛选得到与PARP抑制剂具有明显协同效应的糖原合成激酶3(Glycogen synthase kinase 3,GSK3)抑制剂。之后,我们对PARP抑制剂与GSK3抑制剂的协同效应进行了体内外实验的验证并深入研究了其作用机制。本研究选用两个批准上市的PARP抑制剂olaparib和niraparib,与99个针对50个抗肿瘤靶点的小分子抑制剂在BRCA缺陷但是对PARP抑制剂敏感性较差的HCC1937和HCT-15细胞株中进行了联用筛选。结果表明,在HCT-15细胞株中,olaparib和niraparib与两个GSK3抑制剂LY2090314和CHIR99021 HCl显示出了最强的联用增敏效果。体外增殖抑制实验表明,在HCT-15细胞中,5个PARP抑制剂simmiparib,olaparib,niraparib,rucaparib和talazoparib在联合应用对细胞增殖抑制无明显影响浓度的GSK3抑制剂LY2090314和CHIR99021HCl时,均具有一定程度的增敏效应。特别地,当simmiparib联合应用5μM的LY2090314时,其增敏倍数高达4463倍。G2/M期阻滞和细胞凋亡的实验结果进一步证明了该联用组合的效果。采用联合指数法对simmiparib与LY2090314和CHIR99021 HCl的协同效应评价结果显示,在6株结肠癌细胞中,simmiparib与LY2090314或CHIR99021 HCl联用时,其对应的平均联合指数(combination index,CI)值均在0.6以下,提示该类联用组合具有普遍性。由于上述两个GSK3抑制剂对GSK3α和GSK3β没有选择性,我们构建了二者的敲除株以考察其在协同效应中发挥的作用。细胞增殖抑制实验表明,GSK3β敲除而非GSK3α能够增强PARP抑制剂的体外抗肿瘤作用。此外,我们发现GSK3β抑制或敲除与拓扑异构酶I抑制剂和羟基脲也具有较好的协同效应,而对拓扑异构酶II抑制剂无效。因此,推测GSK3β可能参与复制依赖的DNA双链损伤产生或修复过程。进一步实验结果表明,GSK3β抑制或敲除能够明显增强PARP抑制剂诱导蓄积p-Chk1、p-RPA32和γ-H2AX的能力,同时也能够使PARP抑制剂诱导有丝分裂异常细胞的比例明显增加。以上结果提示,GSK3抑制剂与PARP抑制剂的联用可以导致复制叉压力增加、DNA损伤蓄积以及有丝分裂灾难发生。DNA双链损伤修复报告系统以及RAD51灶免疫荧光实验结果表明,GSK3β抑制和敲除能够明显抑制同源重组修复过程,而对非同源末端连接没有明显影响。分子机制研究表明,GSK3β抑制和敲除能够明显下调同源重组关键因子BRCA1的m RNA和蛋白水平。此外,在亲本细胞中过表达野生型GSK3β以及在GSK3β敲除细胞株中回补野生型GSK3β均能够明显上调BRCA1的蛋白表达。已有文献报道,在乳腺癌细胞中,GSK3β通过Wnt3α/Snail/Slug信号通路调控BRCA1的转录水平;然而尚未对Snail/Slug负调控BRCA1的生理功能进行阐明。在我们的体系中,发现GSK3β同样通过转录抑制子Snail和Slug来调控BRCA1的表达,从而影响同源重组功能和PARP抑制剂的敏感性。BRCA1的表达水平可能是PARP抑制剂和GSK3抑制剂发挥协同效应的重要因素之一。在BRCA1缺陷的UWB1.289细胞中,simmiparib与LY2090314或CHIR99021 HCl的协同效应较弱,平均CI值分别为0.68和0.87;而在其BRCA1回补细胞株中,协同效应明显增强,平均CI值分别为0.30和0.38。此外,在HCT-15和RKO细胞中下调BRCA1的蛋白表达之后,能够明显减弱PARP抑制剂和GSK3抑制剂的协同效应。以上结果提示,BRCA1水平与该联用组合的增敏效果正相关。最后,我们在裸小鼠皮下移植瘤模型中考察了simmiparib与GSK3β抑制或敲除的体内联用效果。结果显示,simmiparib和LY2090314联用组能够显著抑制HCT-15和RKO裸小鼠移植瘤的生长,T/C比分别为20.82%和45.67%;而它们各自的单用组均没有明显作用。联用后,小鼠体重未发生明显变化,提示联用没有明显增加毒性。与体外结果一致,GSK3β抑制剂能够明显下调瘤组织中BRCA1的蛋白表达,并且与simmiparib联用后上调γ-H2AX和Caspase3剪切蛋白的表达。同时,发现simmiparib对HCT-15 GSK3βKO的移植瘤生长具有一定的抑制作用。综上所述,我们通过高通量筛选的方法首次发现与PARP抑制剂具有明显协同效应的GSK3抑制剂,并采用多种方式在多株结肠癌细胞株以及裸小鼠皮下移植瘤模型中对其协同效应进行了验证。在作用机制方面,GSK3β抑制和敲除能够通过Wnt/Snail/Slug通路下调BRCA1的m RNA和蛋白水平,从而介导了同源重组修复缺陷,最终增敏了PARP抑制剂。基于上述实验,我们揭示了在结肠癌细胞中PARP抑制剂与GSK3抑制剂良好的体内外协同效应及其作用机制,为该类联合用药临床试验的开展提供了实验数据,也为结肠癌的治疗提供了新策略。