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糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是导致终末期肾衰的主要原因之一,进一步明确糖尿病肾病的发病机制,延缓其病情进展是目前亟待解决的问题。我们先前的研究表明,高糖诱导肾小球系膜细胞增生过度(GlomerularMesangial Cells,GMC),分泌转化生长因子β1(transforming growthfactot-β1,TGF-β1),结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF),促进细胞外基质沉积,从而导致肾脏纤维化,是糖尿病肾病的基本特点。
酪氨酸蛋白激酶2/信号转导与转录激活子(activation of Janus kinase2/signal.transducers and activators of transcription,JAK2/STAT)通路在糖尿病肾病发病过程中的作用一直是研究的热点,抑制JAK2-STAT通路激活的有害作用对于治疗糖尿病合并症尤其糖尿病肾病意义重大,普罗布考是一种降血脂药物,同时具有抗氧化功能,在与免疫性疾病相关系统疾病的治疗中也具有强大的作用,但其作用机理仍有待进一步研究。值得注意的是:通过干扰素γ(IFN-γ)诱导的细胞生长抑制作用需要激活STAT1,即IFN-γ的抗增殖活性通过STAT1的激活而加强,而如果抑制STAT1磷酸化可使其抗增殖活性减弱。STAT1可能是一个关键的保护因子,并将成为今后治疗糖尿病肾病的一个新的靶点。
我们研究不同糖浓度下人肾小球系膜细胞(Hunlan Mesangial Cells,HMC)增殖和分泌促纤维化因子的变化,不同糖浓度下人肾小球系膜细胞内JAK2/STAT通路的激活状况;并研究普罗布考和IFN-γ对JAK2/STAT通路的调控作用和进一步对高糖状态下人肾小球系膜细胞的增殖状况和分泌促纤维化因子变化的影响。
方法：
1、高糖状态下肾小球系膜细胞JAK2/STAT通路表达变化及作用的研究体外培养人肾小球系膜细胞,第3-6代细胞用于实验。实验分为3组:正常糖浓度组(NG,5.5mmol/L葡萄糖),对照组(NG+19.5mmol/L甘露醇),高糖浓度组(HG,25 mmol/L葡萄糖),刺激时间为48小时。应用MTT方法检测在刺激48小时后各组细胞增殖状况;并在48小时刺激结束后分别收取各组细胞,提取mRNA,进行RT-PCR实验检测TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平;提取总蛋白,进行Western-b1ot实验检测TGF-β1、CTGF蛋白变化情况,检测JAK2、P-JAK2、STAT1、P-STAT1、STAT3、P-STAT3蛋白变化情况。
2、JAK2/STAT通路抑制调节普罗布考对高糖状态下肾小球系膜细胞保护作用的研究体外培养人肾小球系膜细胞,第3-6代细胞用于实验。实验分为6组:正常糖浓度组(NG,5.5mmol/L葡萄糖),高糖浓度组(HG,25 mmol/L葡萄糖),以及高糖添加不同浓度普罗布考(25μ mol/L,50μmol/L,75μ mol/L,100μ mol/L)药物组,刺激时间为48小时。首先应用MTT方法分别检测在刺激结束后各组细胞增殖状况,筛选出合适的普罗布考药物浓度；之后按照筛选后的实验分组在48小时刺激结束后分别收取各组细胞,提取mRNA,进行RT-PCR实验检测TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平；提取总蛋白,进行Western-blot实验检测TGF-β1、CTGF蛋白变化情况,检测JAK2、P-JAK2、STAT1、P-STAT1、STAT3、P-STAT3蛋白变化情况。
3、激活JAK2/STAT1通路保护高糖状态下肾小球系膜细胞的研究体外培养人肾小球系膜细胞,第3-6代细胞用于实验。实验分为6组:正常糖浓度组(NG,5.5mmol/L葡萄糖),高糖浓度组(HG,25mmol/L葡萄糖),高糖添加不同浓度IFN-γ(10U/ml,100U/ml,500U/ml)药物组,HG+100U/ml IFN-γ+50μ mol/l氟达拉滨组,刺激时间为48小时。首先应用MTT方法分别检测在刺激结束后各组细胞增殖状况,筛选出合适的IFN-γ药物浓度；之后按照筛选后的实验分组在48小时刺激结束后分别收取各组细胞,提取mRNA,进行RT-PCR实验检测TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平；提取总蛋白,进行Western-blot实验检测TGF-β1、CTGF蛋白变化情况,检测JAK2、P-JAK2、STAT1、P-STAT1蛋白变化情况。
结果：
1、高糖状态下肾小球系膜细胞JAK2/STAT通路表达变化及作用的研究刺激48小时后,与NG组和对照组相比,HG组P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3蛋白表达增加,有统计学意义。JAK2、STAT1、STAT3蛋白表达无统计学差异。NG组与对照组JAK2、STAT1、sTAT3、P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3蛋白表达均无统计学差异。与NG组和对照组相比,HG组人系膜细胞增殖增加,有统计学意义;NG组与对照组系膜细胞增殖无明显差异。与NG组和对照组相比,HG组TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平增高,有统计学意义,NG组与对照组无明显差异。刺激48小时比较与NG组和对照组相比,HG组TGF-β1以及CTGF蛋白表达增加,有统计学意义,NG组与对照组无明显差异。
2、JAK2/STAT通路调节普罗布考对高糖状态下肾小球系膜细胞保护作用的研究刺激48小时后,与NG组相比,HG组P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3蛋白表达增加,有统计学意义,JAK2、STAT1、STAT3蛋白表达无统计学差异。高糖添加普罗布考(50μ mol/L,75μ mol/L,100μmol/L)药物组与HG组对比,P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3蛋白表达减少,JAK2、STAT1、STAT3蛋白表达无统计学差异。与NG组相比,HG组人系膜细胞增殖增加,有统计学意义。高糖添加普罗布考(50μ mol/L,75μ mol/L,100μ mol/L)药物组与HG组对比,系膜细胞增殖减少,有统计学意义,且与普罗布考浓度呈正相关;其中75μ mol/L以及100μ mol/L普罗布考显示对细胞增殖过度抑制。HG组TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平增高,高糖添加普罗布考(25μ mol/L,50μmol/L)组TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平减低。HG组TGF-β1以及CTGF蛋白表达增加,高糖添加普罗布考(25μ mol/L,50μ mol/L)组TGF-β1以及CTGF蛋白表达减低。
3、激活JAK2/STAT1通路保护高糖状态下肾小球系膜细胞的研究刺激48小时后,与NG组相比,HG组P-STAT1、P-JAK2蛋白表达增加,有统计学意义,JAK2、STAT1蛋白表达无统计学差异。HG+100U/ml IFN-γ组与HG组对比,P-STAT1蛋白表达增加,JAK2、P-JAK2、STAT1蛋白表达无统计学差异,JAK2、P-JAK2、STAT1蛋白表达无统计学差异。HG+1000U/ml IFN-γ+50μ mol/l氟达拉滨组P-STAT1表达减少,JAK2、P-JAK2、STAT1蛋白表达无统计学差异。与NG组相比,HG组人系膜细胞增殖增加,有统计学意义。高糖添加不同浓度IFN-γ(10U/ml,100U/ml,500U/ml)药物组与HG组对比,系膜细胞增殖减少,有统计学意义,且与IFN-γ浓度呈正相关;其中500U/mlIFN-γ显示对细胞增殖过度抑制。HG组TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平增高,高糖添加不同浓度IFN-γ(10U/ml,100U/ml)药物组rGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平减低。HG组TGF-β1以及CTGF蛋白表达增加,高糖添加不同浓度IFN-γ(10U/ml,100U/ml)药物组TGF-β1以及CTGF蛋白表达减低,HG+100U/ml IFN-γ+50μ mol/l氟达拉滨组TGF-β1以及CrGF蛋白表达增加。
结论
1、高糖状态下JAK2/STAT通路激活,人肾小球系膜细胞增殖增加,分泌促纤维化因子TGF-β1和CTGF增加。
2、普罗布考可抑制高糖状态下肾小球系膜细胞内JAK2/STAT通路激活。普罗布考可抑制高糖状态下人肾小球系膜细胞的过度增殖,抑制高糖引起的肾小球系膜细胞分泌促纤维化因子TGF-β1和CTGF增加;JAK2/STAT通路的调节与普罗布考对高糖状态下肾小球系膜细胞的保护相关。
3、IFN-γ可促进高糖状态下肾小球系膜细胞内STAT1激活;IFN-γ可抑制高糖状态下人肾小球系膜细胞的过度增殖,抑制高糖引起的肾小球系膜细胞分泌促纤维化因子TGF-β1和CTGF增加;氟达拉滨可抑制STAT1激活,导致肾小球系膜细胞分泌促纤维化因子TGF-β1和CTGF增加。STAT1是高糖状态下肾小球系膜细胞的一个保护性因子。