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[研究背景与目的]结直肠癌远处转移是导致患者死亡的主要原因之一,其中约1/3的远处转移部位为肝脏转移。在结直肠癌转移机制中,失巢凋亡抵抗是肿瘤转移启动的重要条件。CCL20和CXCL8可介导结肠癌细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)以及失巢凋亡抵抗,其中PI3K/AKT-ERK信号通路具有关键作用。厄洛替尼(Erlotinib)是一种效果好、选择性较高且具有口服活性的表皮生长因子受体抑制剂。厄洛替尼联合贝伐珠单抗治疗晚期结肠癌患者后生存获益明显,但是厄洛替尼抑制结肠癌的分子机制尚不清楚。TrkB是厄洛替尼治疗非小细胞肺癌的效应分子位点;厄洛替尼能显著抑制神经母细胞瘤中ERK1/2磷酸化和转录激活因子3(STAT3)表达,从而抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移。因此,研究厄洛替尼与TrkB/ERK信号通路的关系,对治疗晚期结肠癌患者具有重要的临床意义。[方 法]首先,用外源性的CXCL8预处理的人类结肠癌细胞株SW480和Caco-2,用于评估Erlotinib对其肿瘤转移的抑制作用。1、为探讨厄洛替尼对CXCL-8诱导的结肠癌失巢凋亡的影响,用不同浓度的厄洛替尼处理用CXCL-8预处理24h的结肠癌细胞48h,采用CCK-8法来测定细胞的存活率。2、细胞迁移和侵袭测定。2.1细胞迁移测定:(1)观察细胞的生长情况,在生长情况到达80-90%时进行划痕实验以观察细胞迁移情况。(2)将细胞按照2×10 5个细胞/ml的密度接种到24孔板上,并培养24个小时。(3)用10-μl无菌移液管尖端制备线性划痕,并在细胞内加入PBS、CXCL8、CXCL8+Erlotinib。在倒置显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)下观察到划痕伤口愈合。2.2采用transwell实验观察结肠癌细胞侵袭情况。3、构建TrkB过表达序列的结肠癌细胞。pDONR223空载体用作为对照。采用Western blot检测TrkB过表达的肠癌细胞株失巢凋亡、EMT、侵袭和转移相关蛋白的表达情况。4、采用western blot测定凋亡相关的蛋白表达、EMT相关基因的蛋白质表达、测定TrkB的表达,Akt/ERK磷酸化水平及其他相关蛋白的表达。5、细胞凋亡实验使用的是Annexin-V凋亡检测试剂盒(BD Biosciences,San Diego,CA)对细胞进行染色。通过流式细胞术(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)测定染色的细胞,并通过 FCS Express v2.0 软件(De Novo Software,Los Angeles,CA,USA)进行分析。6、加入分别抑制ERK和Akt的U0126和MK2206后,western blotting测定EMT相关蛋白表达、检测肠癌细胞中p-ERK和ERK,p-Akt和Akt水平。[结 果]1.1、流式细胞术测定的结果显示,与CXCL8预处理的SW480细胞和Caco-2细胞相比,用CXCL8加厄洛替尼处理的SW480细胞和Caco-2细胞中的细胞凋亡率显著增加(p<0.01)。Western印迹分析显示,CXCL8处理导致Caspase-3的活化,PARP和Bax/Bcl-2蛋白比率的显著降低,但厄洛替尼给药有效地恢复了这种趋势(p<0.01)。这些发现表明厄洛替尼可以抑制CXCL8诱导的结肠癌失巢凋亡抗性。1.2、Transwell实验结果表明厄洛替尼可有效逆转SW480细胞和Caco-2细胞的CXCL8增强的细胞侵袭能力(p<0.01)。同样的,细胞划痕伤口测定显示厄洛替尼显著减轻CXCL8诱导的细胞迁移增强(p<0.01)。1.3、Western blot分析结果显示用CXCL8预处理的SW480和Caco-2细胞中加入厄洛替尼后E-钙粘蛋白水平显著上调,然而厄洛替尼治疗后的SW480和Caco-2细胞中N-钙粘蛋白和波形蛋白水平显著下调(p<0.05,p<0.01)。1.4、CXCL8显著增加了 SW480和Caco-2细胞的TrkB蛋白水平(P<0.01);但厄洛替尼抵消了 CXCL8的调节作用(P<0.01)。此外,蛋白质印迹结果显示厄洛替尼显著抑制CXCL8诱导的p-ERK/ERK和p-Akt/Akt的上调。2、TrkB过表达的肠癌细胞构建成功,用于探讨TrkB过表达对结肠癌进展的影响。2.1、流式细胞学检测过表达TrkB的肠癌细胞凋亡结果显示,与正常SW480细胞相比,TrkB过表达的SW480细胞的凋亡率明显降低。使用厄洛替尼后,与未加厄洛替尼处理的细胞相比,TrkB过表达的CXCL8预处理SW480细胞的凋亡率升高(P<0.05)。2.2、厄洛替尼对肠癌细胞EMT的影响:使用厄洛替尼治疗后,Western blot结果显示,SW480细胞中E-cadherin水平上调,N-cadherin和Vimentin下调(p<0.01),但TrkB过表达改变了这种效应(p<0.01)。2.3、Transwell实验结果显示TrkB过表达SW480细胞的侵袭能力明显高于正常的SW480细胞,TrkB过表达的SW480细胞经厄洛替尼治疗后侵袭能力降低(p<0.01);划痕实验的数据表明,结肠癌细胞的迁移和侵袭具有显著的相似性(p<0.05,p<0.01)。2.4、使用厄洛替尼后,SW480细胞的TrkB、p-ERK/ERK和p-Akt/Akt水平显著降低(p<0.01),但在TrkB过表达的SW480肠癌细胞中,这种趋势得到了明显的逆转(p<0.05,p<0.01)。3.1、在加入U0126后,p-ERK/ERK的水平显着下降(p<0.01);同时,与CXCL8处理的细胞相比,在CXCL8加U0126处理的SW480细胞中也发现E-钙粘蛋白的上调,及N-钙粘蛋白和波形蛋白表达的明显下调(p<0.01)。3.2、加入MK2206后,p-AKT/AKT水平显着受到抑制(p<0.01),但p-ERK/ERK的水平并没有明显改变(p>0.05);此外,相对于CXCL8处理的SW480细胞,E-钙粘蛋白,N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达略有上调(p>0.05)。3.3、在添加U0126后,发现SW480和Caco-2细胞中的失巢凋亡率显着增加(p<0.01),但MK2206的使用未引起显着变化(p>0.05)。相似地,在U0126处理的细胞中也发现了细胞侵袭和迁移能力的明显降低(p<0.01),但在MK2206处理的细胞中几乎没有变化(p>0.05)。[结 论]1、厄洛替尼可以抑制CXCL8诱导的结肠癌细胞的失巢凋亡抵抗、侵袭和迁移能力,以及EMT的发生。2、厄洛替尼是通过下调TrkB依赖的ERK途径而不是AKT途径来抑制结肠癌EMT、迁移和侵袭。