Norrin基因是一种富含半胱氨酸的糖基化蛋白质，属于分泌型生长因子，其C末端有半胱氨酸富集区域，提示其可能具有生长因子作用，可能与内皮细胞的移行和增殖有关。现有研究结果表明，Norrin基因缺陷鼠视网膜表现为表层视网膜血管网发育迟缓和深层毛细血管网缺失。若将外源性Norrin转入这种基因缺陷鼠的视网膜，可以恢复视网膜血管网的形成，改善视网膜结构，恢复视网膜部分功能。随着对Norrin基因研究工作的开展，Norrin与视网膜血管的关系引起了越来越多人的关注。在此研究中，我们观察了Norrin高表达对体外培养的人视网膜血管内皮细胞及正常新生小鼠视网膜血管发育中的作用，并观察了Norrin在视网膜新生血管发生过程中的动态改变。包括： 第一部分人视网膜微血管内皮细胞的分离、培养与鉴定目的：体外培养并鉴定人类视网膜微血管内皮细胞(HRCECs)。方法：2％胰蛋白酶和0.066％Ⅱ型胶原酶消化视网膜，获得视网膜微血管组织，用纤维连接蛋白包被培养皿促进内皮细胞贴壁，用含10％胎牛血清的添加内皮细胞生长因子和胰岛素-转铁蛋白-硒添加物的内皮细胞培养基培养。抗第Ⅷ因子相关抗原抗体及透射电镜观察鉴定内皮细胞。MTT法绘制细胞生长曲线。 结果：内皮细胞第1d贴壁，第2d有细胞从组织块中爬出，第5d形成克隆，2w左右细胞融合。传至7～8代转化为成纤维细胞。第Ⅷ因子相关抗原鉴定细胞免疫组化为强阳性。 结论：利用10％胎牛血清的人内皮细胞培养基，添加内皮细胞生长因子和胰岛素-转铁蛋白-硒添加物，并用纤维连接蛋白包被培养瓶，能简单有效地培养出人视网膜微血管内皮细胞。 第二部分Norrin基因对HRCECs作用的体外研究目的：探讨AP-3myc-hNorrin/pRK5质粒转染HRCEC后对细胞增殖、迁移、细胞周期及凋亡的影响。 方法：以体外培养的HRCECs为模型，利用Lipofectimine2000脂质体转染，设空白和阴性对照，RT-PCR检测Norrin，免疫组化和Western-Blot检测myc在细胞的含量确定转染效率。采用MTT法测定细胞增殖，流式细胞术分析其细胞周期和凋亡,boyden小室法检测内皮细胞迁移。 结果：AP-3myc-hNorrin/pRK5质粒转染组细胞增殖和迁移数分别较对照组高，有统计学差异(P=0.001)。细胞周期检测示质粒转染组G2期细胞较对照组高(P=0.001)。细胞凋亡检测见质粒转染组凋亡细胞比例较对照组低(P=0.005)。结论：Norrin高表达能促进人视网膜微血管内皮细胞(HRCECs)增殖、迁移及DNA合成，同时抑制细胞凋亡，提示Norrin在视网膜血管生成中可能具有重要作用。 第三部分Norrin基因对新生小鼠视网膜血管发育的影响 目的：探讨Norrin高表达对正常新生鼠视网膜血管发育的影响。 方法：新生3日龄(P3)C57BL/6小鼠，左眼为实验眼，玻璃体腔注入mNorrin-myc-AP/pRK5表达质粒，右眼注入等量生理盐水作为阴性对照。RT-PCR方法半定量检测视网膜内Norrin表达变化观察转染情况。视网膜铺片及切片GSA(Lectin)染色观察视网膜血管范围和形态，伊文思蓝视网膜铺片观察视网膜血管内屏障功能情况。 结果：P6时，实验眼视网膜中NorrinmRNA表达水平较对照眼表达高，表明mNorrin-myc-AP/pRK5表达质粒成功转染入视网膜。P6时实验眼视网膜表层血管网开始进入退化阶段，P8时出现视网膜浅层血管向深层出芽，P10时深层血管已发育接近完全。而对照组P6时实验眼视网膜表层血管网丰富，P8时视网膜浅层血管向深层出芽少，P10时深层血管尚未发育完全。与对照眼比较，小鼠视网膜血管发育过程提前。伊文思蓝视网膜铺片观察实验组视网膜血管无渗漏，具有良好的屏障功能。 结论：Norrin高表达能促进视网膜血管特别是深层血管的发育和分化。Norrin可能在视网膜血管生成和管壁构筑过程中起到重要作用。 第四部分氧诱导的视网膜病变小鼠模型建立方法的改良目的：建立简单、稳定、成模率高的氧诱导的视网膜病变小鼠模型。 方法：用改良法(A组)和传统方法(B组)分别建立氧诱导的视网膜病变的C57BL/6小鼠模型，比较两组的母鼠死亡率、乳鼠体重、成活率和成模率，视网膜冰冻切片GSL染色免疫组化观察两组的视网膜新生血管，荧光素灌注视网膜铺片检测视网膜无灌注区和新生血管的面积。 结果：改良法(A组)与传统法(B组)相比较，乳鼠成活率未降低，且具有母鼠死亡率低，成模率高，动物消耗量少的特点。改良法制作的小鼠模型视网膜无灌注区和新生血管面积较传统法多而典型。 结论：改良法操作简单，能构建出高效、稳定、典型的视网膜新生血管模型。该方法值得推广和借鉴。 第五部分NorrinmRNA在氧诱导的血管增殖性视网膜病变中的动态表达 目的：探讨氧诱导的血管增殖性视网膜病变的小鼠视网膜中NorrinmRNA的表达变化及其意义。 方法：取P7、P12、P17的氧诱导血管增殖性视网膜病变小鼠，荧光素灌注视网膜铺片观察血管分布和形态。逆转录—聚合酶链式反应方法检测P7、P8、P12、P12.5、P13、P14、P15、P17、P19等时间点的小鼠视网膜中Norrin、VEGF、HIF-1αmRNA的表达。 结果：氧诱导血管增殖性视网膜病变小鼠在P17时视网膜有大量新生血管形成。缺氧12小时后，NorrinmRNA有显著升高，缺氧24小时时到达高峰，然后缓慢下降。其变化趋势与VEGF、HIF-1αmRNA的变化一致。 结论：NorrinmRNA在缺氧视网膜中明显升高，并与VEGF和HIF-1α的变化一致。Norrin很可能积极参与了新生血管的形成，并起着重要的调控作用。