广东省白纹伊蚊内共生菌Wolbachia的检测及其生理功能研究

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白纹伊蚊Aedes albopictus属于昆虫纲Insecta蚊科Culicidae伊蚊属Aedes,俗称麻蚊、花蚊、阴蚊,又名“亚洲虎蚊”。白纹伊蚊适应性强、扩散能力强,在全球范围内广泛存在,是世界性的重要病媒生物,在我国大部分地区均有分布。白纹伊蚊雌虫滋扰人群,叮人并吸食人血用于繁殖后代,且可在叮咬的过程中传播登革热、寨卡病毒病、基孔肯亚热、黄热病、裂谷热等疾病的病原,严重危害人类公共健康。近年来,我国登革热的发生越来越频繁,发生区域逐渐北移,成为日益严重的急性传染病。广东省的登革热发生尤为严重,近来每年均有暴发。目前,国内外对防治白纹伊蚊新技术的研究越来越多,其中利用内共生菌进行防治是近年重要的研究方向。本论文以广东省白纹伊蚊为研究对象,通过三种方法监测了其在全省21个地市的分布、季节消长等情况,采用分子生物学检测技术调查了各地白纹伊蚊感染内共生菌Wolbachia的情况及其分化关系,并研究了内共生菌Wolbachia对白纹伊蚊生物学特性和抗药性的影响。主要研究结果如下:1.广东省2007-2017年白纹伊蚊种群密度调查研究采用布雷图指数法、诱蚊诱卵器指数法和诱蚊灯法三种监测方法,于2007-2017年在全省21个地市,每月两次监测白纹伊蚊密度。监测结果揭示了白纹伊蚊在广东全省分布,全年均有发生,夏秋季的种群密度显著高于春冬季。布雷图法监测伊蚊幼蚊密度,共调查9506102户,BI均值2.94,低于安全阈值5;诱蚊诱卵器指数法监测伊蚊成蚊密度,共布放有效诱蚊诱卵器1428078个,MOI均值4.98,低于安全阈值5;诱蚊灯法监测伊蚊成蚊密度,共有效布放诱蚊灯82019台,总体伊蚊密度为0.21(只/灯·夜)。结果表明三种不同方法监测白纹伊蚊密度,布雷图指数(BI)波动最大,诱蚊灯法次之,诱蚊诱卵器指数(MOI)波动最小。同时,三种方法在不同的环境下监测的敏感性不同,布雷图指数在农村居民区最高,诱蚊诱卵器指数和诱蚊灯伊蚊密度在公园最高。2.广东省白纹伊蚊感染内共生菌Wolbachia现况研究累计检测的3780头试虫样本中,阳性雌虫936头,阳性雄虫919头。全省白纹伊蚊感染内共生菌Wolbachia概率为49.07%,雌虫感染率49.52%,雄虫感染率48.62%。2015-2017年,全省白纹伊蚊内共生菌Wolbachia感染率分别为39.13%、48.97%、59.13%。全省白纹伊蚊Wolbachia感染率主要呈现上升趋势,且21个地市的感染率及变化各不相同。分析各地白纹伊蚊的感染率与其密度,推测Wolbachia的感染率受诸多因素的影响,与伊蚊密度的消长变化没有直接的关联。3.广东省白纹伊蚊内共生菌Wolbachia株系及进化关系分析研究分析了不同地区白纹伊蚊内共生菌Wolbachia株系以及相应的进化关系。wsp基因序列检测结果表明,共有222条序列被划分在2个超级群组的2个进化分支中,分别为B大组Pip株系和A大组AlbA株系株系。B大组Pip株系Wolbachia为最主要的株系,在21个地市白纹伊蚊雌、雄虫中均有感染;A大组AlbA株系Wolbachia感染了7个地市部分白纹伊蚊,包括云浮、东莞、汕头、潮州、广州的雌虫,阳江雄虫,中山雌、雄虫。引入MLST基因,结合wsp基因测序结果表明,白纹伊蚊内共生菌Wolbachia株系主要分布在B大组,包括21个地市白纹伊蚊雌、雄虫;少数分布在A大组,有广州、潮州、揭阳、佛山4个地市。4.内共生菌Wolbachia对白纹伊蚊生物学特性的影响研究分析了B大组Pip株系Wolbachia对白纹伊蚊生长发育的影响,结果表明阳性白纹伊蚊种群的卵-成虫期发育历期比阴性种群短,其中卵期、二龄的发育历期长于阴性种群,其他龄期均短于阴性种群。阳性种群的卵-成虫期存活率低于阴性种群,其中三龄存活率高于阴性种群,其他龄期存活率均低于或者等于阴性种群。阳性种群的雌雄比低于阴性种群,而产卵前期明显比阴性种群长。根据种群特定时间生命表参数分析,阴性种群的寿命长于阳性种群,平均单雌产卵量高于阳性种群,阳性种群内禀增长率和周限增长率高于阴性种群。5.内共生菌Wolbachia对白纹伊蚊抗药性的影响分别测定B大组Pip株系Wolbachia阳性白纹伊蚊种群和阴性种群的抗性水平。实验结果表明,高效氯氰菊酯、氯菊酯、溴氰菊酯、马拉硫磷、残杀威5种药剂对阳性种群成蚊的致死率分别为97.78%、75.56%、86.67%、88.89%、91.11%,对阴性种群成蚊的致死率分别为98.89%、56.67%、81.11%、87.78%、86.67%。两种群对氯菊酯均为抗性,对溴氰菊酯、马拉硫磷、残杀威均为可能抗性。阳性种群对这4种药物的死亡率均高于阴性种群,表明其对上述药物的反应更加敏感。高效氯氰菊酯、氯菊酯、溴氰菊酯、双硫磷、残杀威对阳性种群幼虫的致死中浓度(LC50)分别为0.0563mg/L、0.0518 mg/L、0.055 mg/L、0.0076 mg/L、1.5487 mg/L,与敏感品系相比较后分别判定抗性水平为敏感、敏感、低抗、敏感和敏感。结果揭示了B大组Pip株系Wolbachia改变了白纹伊蚊成蚊和幼虫对常见药物的抗性水平,使白纹伊蚊对菊酯类、氨基甲酸酯类、有机磷类杀虫药物更加敏感。
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