蛋白质的体外复性研究不仅对基因工程重组蛋白质的生产具有重要意义,而且对探索蛋白质错误折叠导致疾病的机理也具有积极的指导作用。本文以变性还原溶菌酶为模型蛋白质,研究了不同折叠辅助因子对促进蛋白质复性的作用;复性动力学特性;以及辅助因子与色谱耦合作用提高蛋白质复性收率的途径。首先研究了分子伴侣,固定化分子伴侣以及固定化分子伴侣色谱辅助蛋白质复性特性。结果表明,在1 mol/L的最佳盐酸胍浓度下,固定化分子伴侣色谱法的最高复性收率可达到97%,复性产率达到54 mg/L.h,是尺寸排阻色谱法的4倍,证明固定化分子伴侣色谱复性方法在高通量复性方面具有明显的优势。为了解明分子伴侣辅助蛋白质复性的动力学特性,建立了分子内折叠与分子间聚集的竞争反应动力学模型。模型分析表明,分子伴侣的存在可有效抑制聚集体的生成,降低聚集体反应级数(为2级反应);三磷酸腺苷(ATP)作为多肽链释放驱动剂是十分重要的,GroEL和ATP的同时作用可提高复性速率2倍以上;在一定的酶浓度下,添加适当GroEL和ATP浓度,可实现蛋白质的高收率和高速度复性。其次研究了人工伴侣系统,即十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)+β-环糊精(β-CD)促进高浓度变性溶菌酶的复性作用。结果表明,人工伴侣系统的辅助复性收率较直接稀释的自发复性提高约70%,比仅有β-CD存在下的复性提高约40%。动力学分析表明,人工伴侣存在下聚集体的生成为三级反应,与直接稀释复性相同;盐酸胍和人工伴侣的作用都是抑制聚集体的生成,并且两者具有协同作用,利用此协同效应,可使高浓度的酶(1mg/mL)获得高收率复性(>80%)。此外,若有人工伴侣的存在,在较低浓度的盐酸胍条件下就可实现快速、高收率的蛋白质复性。根据上述人工伴侣辅助复性的研究成果,提出了尺寸排阻色谱与人工伴侣耦合作用促进蛋白质复性的耦合复性方法,并实验证明该方法的有效性。利用此方法,获得较高的复性收率的色谱流速高于单纯的尺寸排阻色谱,因此利用耦合色谱有利于提高蛋白质复性产率。另外,该方法还可实现连续色谱复性,因此可获得较高的产物浓度和复性收率,具有实际应用前景。最后,研究了各种简单稀释添加剂的辅助复性效果和动力学特性。证明添加剂可分为两类,一类如乙酰胺、硫脲、丙酮和精氨酸,它们与盐酸胍类似,既抑制分子间聚集,又抑制分子内折叠,因此,存在最佳浓度使复性收率最高;另一类如甘油,为天然蛋白质稳定剂,可促进分子内折叠,提高复性速率和收率。但达到一定浓度后继续增大其浓度对复性收率影响很小。