由于BirA酶生物素化的能力,其作为一种重要的试剂已广泛用于蛋白质分子之间相互作用的研究,特别是细胞表面受体-配体相互作用的研究。本研究目的:构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶。方法:用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入pET32a中构建BirA酶-Trx融合蛋白基因的重组表达载体pET32a–BirA。经测序验证后,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,通过SDS-PAGE电泳初步检测,筛选高表达菌株。对高表达菌株进行发酵罐高密度发酵表达,表达产物采用金属螯和柱进行纯化。以带有生物素酶底物肽(BirA substrate peptide,BSP)的VR111-BSP蛋白为底物,用ELISA鉴定表达产物的生物素化活性,并研究了BirA酶生物学活性。结果:构建了pET32a–BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达分子量为51779的BirA酶-Trx融合蛋白。表达菌株在30升发酵罐上建立了高密度发酵工艺,发酵密度达到了80 g湿菌体/L发酵液,BirA酶表达量为2.62×107 U/g湿菌体。表达产物经金属螯和柱纯化后,得到N端带有Trx标签的BirA酶蛋白,纯度大于90%。EL ISA的结果显示,表达产物能使底物VR111-BSP蛋白生物素化。并得到了BirA酶的米氏常数Km(19.4μM/min)和最大反应速度Vmax(0.68μM/min)。结论:成功地制备了具有生物学活性的BirA酶,与商业化产品相比具有低成本、高比活的优点。