论文部分内容阅读
阿维链霉菌是阿维菌素的产生菌,由于其发酵液较粘稠而导致溶氧较差,因此溶氧成为阿维菌素产量提高的限制因素之一。本研究旨在通过在阿维链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白基因(vgb)来改善氧的传递,进而改善菌体生长,提高阿维菌素的产量。 对阿维链霉菌原生质体的制备和再生条件进行优化。首先考察了影响阿维链霉菌原生质体形成的因素,发现在R2YE、YMB、SM、YEME几种链霉菌常用的液体培养基中,通过R2YE培养基收获的菌体形成原生质体的效率最高。菌丝培养采用二级培养,即用R2YE培养基28℃培养48h,转种到补加0.25%甘氨酸的R2YE培养基中,28℃继续培养20~24h,溶菌酶作用浓度为2mg·mL-1,30℃酶解30min,在此条件下,原生质体的制备量为6.3×108个·mL-1原生质体的再生率最高,达到1.98%。 应用双亲灭活原生质体融合技术选育阿维菌素高产菌株,得到了一株高产菌株Streptomyces avermitilis F32,阿维菌素总发酵单位达3904μg·mL-1,其中B1a组分产量较高,达1016μg·mL-1,较出发菌株产抗单位提高了117.1%。 利用链霉菌质粒pIJ702和带vgb的大肠埃希菌质粒pUC19-vgb,构建大肠埃希菌-链霉菌穿梭质粒pSY702。将该质粒以PEG-介导的方式转入阿维链霉菌原生质体中,利用硫链丝菌素抗性筛选转化子。CO结合差光谱法检测在420nm处有吸收峰,表明血红蛋白已在阿维链霉菌中表达且具有生物活性。通过高效液相色谱(HPLC)对转化子摇瓶发酵产物进行分析表明,转化子仍然合成阿维菌素,而且转化子在供养不足时生产阿维菌素的能力比对照更强。说明含vgb的转化子比不含vgb的对照菌更能耐受贫氧环境,合成阿维菌素效率更高,在贫氧环境中表现出其优越性。 以筛选到的转化子S.avermitilis T26为实验菌株,对发酵条件进行优化。结果表明随着发酵时间的延长,阿维菌素产量不断提高,发酵10d阿维菌素的产量最高;选用18h的种龄、15%的转种量可使阿维菌素的产量提高。通过均匀设计优化发酵培养基配方,发酵培养基(%)为:玉米淀粉8.0,黄豆饼粉0.7,花生饼粉1.1,酵母粉0.875,酵母膏0.2,玉米浆0.35时,使得S.avermitilis T26的发酵效价提高了38%,B1a发酵单位达到1206μg.mL-1。