[NOR1基因的克隆及前期研究基础]通过抑制性消减杂交和cDNA微阵列技术,发现NOR1的EST W95442在正常鼻咽上皮与鼻咽癌组织中存在表达差异。借助于生物信息学,采用EST介导的cDNA克隆方法,得到了EST W95442相应的NOR1全长cDNA序列。将NOR1转入鼻咽癌细胞HNE1后可以抑制HNE1细胞的生长、增殖。在25例鼻咽癌及4例正常鼻咽上皮组织中发现NOR1的1号外显子区存在一个非同义的编码区单核苷酸多态性(coding Single nucleotide polymorphism, cSNP)(Glu58Gly)。多组织膜Northern-blot分析表明,NOR1在人的骨骼肌表达最高,其次是心、脑、肾、肺。这些组织都是机体代谢功能、细胞呼吸较为旺盛部位。生物信息学预测NOR1含一个Nitro-oxidored domain,编码一种潜在的氧化还原酶,主要定位在胞浆,少量位于线粒体,提示NOR1的功能可能与细胞有氧呼吸和／或细胞的代谢密切相关。[NOR1在多种肿瘤中表达下调,且在缺氧诱导下表达升高]前期原位杂交的研究结果表明,NOR1的表达差异仅在肿瘤与非肿瘤组织之间,并且这种差异与肿瘤的临床病理组织类型和肿瘤的转移无关,提示NOR1的下调是肿瘤发生的早期事件。利用CLONTECH公司的cancer profiling array(包含19种肿瘤组织以及相应的癌旁组织)检测发现：NOR1在肝癌、胰腺癌、肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、外阴上皮癌、前列腺癌、甲状腺癌、睾丸癌、皮肤癌的肿瘤组织中表达明显下调,说明NOR1的表达下调与多种肿瘤的发生密切相关。本研究以及前期研究所检测的肿瘤均为实体瘤,而缺氧是实体肿瘤发生早期的共同事件。作为具有潜在氧化还原酶功能的NOR1,其表达是否会因细胞氧化还原环境的改变(如：缺氧等刺激)而改变?令人惊奇的是,利用缺氧、氯化钴(CoCl2)以及H2O2分别对HeLa细胞进行处理,发现NOR1的表达均明显上调,并且处理后的HeLa细胞周期阻滞在S、G2期(其中缺氧诱导是S期,CoCl2诱导是S、G2期而H2O2则只是G2期)。缺氧诱导因子(hypoxia induced factor, HIF-1α)是通过缺氧应激启动的转录因子,NOR1的上调可能受HIF-1的调节。经antisense-HIF-1转染HeLa细胞并通过CoCl2诱导,NORl的表达并未随HIF-1表达下调而下降,提示NOR1的表达与HIF-1无明显相关。检测肿瘤组织的NOR1表达为下调,而体外的缺氧诱导却使NOR1表达升高,出现这种矛盾是因何原因?[NOR1的表达抑制HeLa细胞的生长并促进细胞凋亡]NOR1的表达明显抑制HeLa细胞的生长及细胞软琼脂集落形成。通过生长曲线结合细胞计数观察转染空白载体及NOR1的HeLa细胞的生长情况,结果显示NOR1过表达细胞的生长速度显著低于转染空白载体的细胞,同时形成的细胞集落明显较少,并且集落的体积也明显变小。NORl使HeLa细胞在增殖过程中DNA的复制受抑而阻滞于S期,并且增加细胞的凋亡。将NOR1的反义互补序列转入HEK293细胞,通过透射电镜观察,发现转染细胞的核／浆比值增加的比例较对照细胞明显增多。从上述结果说明,NOR1可以通过周期抑制和细胞凋亡来抑制宫颈癌细胞的生长,而在非肿瘤细胞中减少NOR1的表达可以增加细胞的恶性表型。[NOR1与细胞的代谢]将转染空白载体及NOR1的HeLa细胞的总RNA与缺氧信号通路微阵列(Oligo GEArray(?) Human Hypoxia Signaling Pathway Microarray:主要包含与缺氧应激相关的基因：应激反应相关基因、氧化还原酶类、缺氧相关转录调节因子以及辅因子、凋亡相关基因、缺氧相关的信号转导基因等)杂交发现,NORl的表达使HeLa细胞内大部分与缺氧相关的基因表达下调,唯一的上调基因是Bax, Bax参与凋亡的正向调节。在表达下调的基因中挑选己糖激酶基因(hexokinase, HK2)、过氧物酶体增殖激活受体α (peroxisome proliferative activated receptor a, PPARA)以及缺氧诱导因子抑制剂(factor inhibit HIF1, FIH-1),通过适时定量PCR验证与微阵列的结果一致。HK2是糖酵解反应的第一个限速酶,它的下调意味着糖酵解过程受抑,而糖酵解功能减弱可以增加抗癌药物的疗效。PPARA调节脂肪酸代谢且与肿瘤的发生相关,微阵列结果示PPARA所调节的下游基因：血管形成素样蛋白4(angiopoietin-like protein4, ANGPTL4)和溶血磷脂酸酰基转移酶2(1-acyl-sn-glycerol3-phosphate acyltransferase2, AGPAT2)均下调,它们分别参与降糖、升脂以及甘油三脂合成代谢功能,同时两个基因编码的蛋白活性下降均可以诱发肿瘤细胞凋亡。FIH-1(又名HIFIAN)是一个Fe(Ⅱ)、2-氧戊二酸依赖的加双氧酶,可以羟化HIF-1转录结构域中的Asp803使其转录活性下降而备受关注,NOR1明显下调FIH-1的表达,提示可能增加HIF-1的转录功能,但微阵列结果所示受HIF-1调节的下游基因表达并无改变,说明NOR1可能调节FIH-1作为氧化还原酶所参与的其他功能。[NOR1通过p53及内质网参与细胞凋亡]在缺氧诱导的凋亡中,p53起着非常重要的作用,而且p53通过抑制DNA的合成使细胞周期阻滞于S期。NOR1的表达使p53的表达上调,同时HeLa细胞的凋亡比例以及被阻滞在S期的细胞明显增加,说明由NOR1引起的凋亡中,p53同样有着举足轻重的作用。将绿色荧光标记的NOR1转入HeLa细胞,用CoCl2、HA分别诱导后,发现两种诱导都使NOR1在内质网上大量聚集,并出现在肿胀的线粒体内。同时分别检测胞浆、线粒体的cytochrome C和caspase9的表达,两个分子均由线粒体移至胞浆。微阵列结果显示,Bax表达上调,BcL-2却表达下调。内质网和线粒体在细胞的凋亡过程中,都是非常重要的细胞器,许多调节和效应分子如：Ca2+、Bax、BcL-2等将两者在细胞凋亡事件中紧密联系在一起。研究者推测,NOR1引起的凋亡可能首先由内质网启动凋亡,导致大量Ca2+的释放,激活BcL-2家族成员Bax,同时BcL-2表达下降增加Ca2+从内质网的释放,线粒体摄取后引起线粒体膜势能下降,导致线粒体肿胀同时释放cytochrome C和caspase9并激活caspase3等一系列凋亡效应分子,将凋亡的信号放大,最终使凋亡的HeLa细胞增加。通过上述的实验结果提示体外实验时,NOR1能抑制肿瘤细胞的生长,促进凋亡,同时NOR1的过表达对抗糖酵解反应并影响脂肪代谢,而体内的缺氧的肿瘤细胞则抑制凋亡并通过糖酵解反应以及脂肪代谢稳定能量供应来适应缺氧的刺激,这可能部分解释前述的同在缺氧环境中,NOR1体内、体外的表达矛盾。通过进一步的研究揭示NOR1的功能可能为肿瘤的发生以及治疗提供新的内容。