香蕉是世界上最重要的水果之一,被联合国粮农组织定为世界第四大粮食作物。香蕉是一种典型的呼吸跃变型果实,其品质形成与调控是香蕉产业发展的关键科学问题,对其生理学及分子生物学研究就成为研究的热点,对香蕉生产具有重要的理论和实践意义。分离与果实成熟相关的基因进而对其进行功能鉴定就成为重要的研究手段,本研究就是基于这一目的,在前期获得的一个MADS-box转录因子基因的基础上,利用模式植物番茄进一步探讨该基因对果实以及其他重要农学性状的调控作用,从而揭示该转录因子基因对香蕉生长发育、果实品质形成与调控的作用机理。本实验室利用SSH和cDNA微列阵相结合的方法,首次克隆到香蕉果实中的一个MADS-box基因,命名为MuMADS2(Musa MADS-box gene).生物信息学和芯片分析表明,该基因编码的蛋白作为转录因子在果实采后早期上调表达。RT-PCR分析表明,该基因仅在香蕉生殖器官(花和果)中表达,在营养器官(根、茎和叶)中不表达,说明MuMADS2的表达具有器官特异性。荧光定量PCR分析表明,MuMADS2在香蕉正常成熟时,达到表达量最高值的时间在乙烯峰之前,说明该基因可能是乙烯的上游调控因子。所以,认为MuMADS2可能在香蕉果实发育和乙烯生物合成过程中起作用。在此基础上将MuMADS2克隆到植物表达载体pCAMBIA1302-m-GFP上,在35S启动子驱动下,产生MuMADS2-GFP融合蛋白。利用基因枪转化法将其转入洋葱表皮细胞进行瞬时表达分析,结果表明,该基因所编码的蛋白主要定位于细胞核中,与亚细胞定位的信息学预测结果相符,符合转录因子特性。为了进一步在植物体内研究MuMADS2基因的功能,将该基因转入番茄,得到37株T0代潮霉素抗性植株。抗性植株的PCR检测结果表明,其中33株表现为阳性。挑选10株表型变化明显的T0代阳性植株进行Southern blot检测,共有8株Southern blot检测为阳性,而且获得的转基因植株插入的拷贝数也有所变化。选取转基因植株中的53号株系(L53),它代表了大部分转基因植株的形态特征。采用RT-PCR的方法对MuMADS2在L53不同器官的表达情况进行分析,结果显示,该基因在转基因植株的根和叶中表达量最高,茎和果实中表达量较低,而在花和萼片中表达量很低,甚至不表达。进一步对L53的根系和不同时期的果实进行GFP检测,结果显示,幼果果肉、绿熟果果肉、红熟果果肉和根系的细胞核中均能检测到不同程度的GFP荧光信号,但是根系中的荧光信号明显大于果肉。对转基因植株进行表型观察发现,大部分转基因植株表现出矮化、生长紧凑、节间短缩、丛生芽、叶片褶皱,颜色暗淡等明显的性状变化。转基因植株种子数显著低于对照,且部分植株表现出高度不育,而且转基因番茄的可溶性固形物含量明显高于对照。综上所述,MuMADS2基因在转基因番茄中控制多个性状表现,而且因其表达部位不同所引起的性状表现也有所不同。在营养器官中表达,表现为生长受到抑制,而在生殖器官中表达则引起不育、可溶性固形物增加等。为了进一步确认这些表型变化确实是由于MuMADS2基因的表达所引起的,以pCAMBIA1302载体为基础,将MuMADS2反向插入到35S启动子下游,GFP基因上游,成功构建了MuMADS2反义植物表达载体,为后续进一步转基因验证功能奠定了基础。