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背景与目的食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)在中国每年新诊断病例约有25万而且世界上食管癌病死率最高的国家也为中国。我国食管癌总发病率为22.14/100,000,死亡率为16.77/100,000,位居癌症死因第四位,尤其是中晚期患者行手术治疗后总的5年生存率不足10%,但TNM分期较早的患者及时行外科手术根治性切除后,其5年生存率能够达到90%以上。因此,提高生存率的关键就在于早期诊断及治疗,而寻找鉴定食管鳞癌发生发展的关键调控因子及其作用的分子机制,对于其早期诊断及靶向治疗均具有重要而深远的意义。目前研究证实包括食管鳞癌在内的多种肿瘤的侵袭转移与上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)具有密切联系,EMT的发生发展过程中的一个关键步骤为转录因子snail通过与E-cadheirn启动子区的E盒结合下调E-cadheirn的表达。目前大量的研究资料表明,钙调节蛋白S100A7在多种恶性肿瘤组织中存在高表达(如头颈部鳞癌、食管癌、胃癌、宫颈癌等),可能参与了肿瘤细胞的增殖分化、发生发展,然而在食管鳞癌的研究中对其机体的分子机制及各影响因子之间的相互作用却缺少深入细致的研究。本项研究中,采用实时荧光定量PCR(Real Time-PCR)及免疫组织化学技术(immunohistochemistry)验证S100A7 m RNA和其相应功能蛋白在食管鳞癌组织、癌旁组织和正常食管组织中的表达水平,然后依据S100A7 m RNA及其蛋白的具体表达水平进一步分析临床病理参数与二者表达量之间的相互关系及其临床意义;然后运用RNAi技术敲减S100A7在食管鳞癌细胞系Eca-109中的表达,研究其表达量下调后对食管癌细胞体外增殖和侵袭能力的影响;进一步研究S100A7表达下调对E-cadheirn,vimentin和snail表达的影响,探讨其与食管鳞状细胞癌发病机制之间的相互关系;最终建立裸鼠移植瘤模型,并观察S100A7 si-RNA注射对荷瘤模型的影响。总之本研究以S100A7作为研究的分子靶点,利用Real Time-PCR、免疫组化及小分子RNA干扰等技术对S100A7在食管鳞癌侵袭转移中的作用及其可能机制进行初步研究和探讨,共分为3个部分。第一部分:S100A7在食管鳞癌组织中的表达研究方法1.采用Real Time-PCR及免疫组化技术验证S100A7 m RNA及其相应的功能蛋白在食管鳞癌组织、癌旁组织及正常食管组织的表达情况,并进一步探究临床病理参数与二者表达水平之间的关系及其临床意义。2.采用Kaplan-Meier生存曲线进一步分析食管鳞癌患者生存预后与S100A7 m RNA及其蛋白表达情况的关系。结果1.采用Real Time-PCR和免疫组织化学方法检测食管鳞癌组织、癌旁组织及正常食管组织中均有S100A7 m RNA和蛋白的表达且表达水平呈依次下降趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。2.S100A7 m RNA及其蛋白的表达与性别、肿瘤分化程度的高低及肿瘤体积的大小之间不存在相关性,差异无统计学意义(P>0.05);但与患者年龄、淋巴结有无转移及TNM分期水平的高低相关,差异有统计学意义(P<0.05)。3.经Kaplan-Meier生存曲线分析后发现食管鳞癌患者生存预后与S100A7 m RNA及其蛋白的表达水平呈负相关。第二部分:S100A7对食管鳞癌侵袭转移能力的影响及其作用的分子机制方法1.采用RNAi技术使得食管鳞癌细胞系Eca-109中S100A7表达下调,并利用Real Time-PCR及Western-blot检测敲减后S100A7 m RNA及蛋白的表达量,利用CCK-8法及Boyden小室检测S100A7表达水平下调对于食管鳞癌细胞株Eca-109增殖及侵袭转移能力的影响。2.采用RNAi技术使S100A7表达下调,观察S100A7表达下调对食管鳞癌细胞株Eca-109表达E-cadheirn,vimentin和snail的影响。结果1.S100A7 si-RNA能成功下调食管癌细胞Eca-109中S100A7 m RNA及蛋白的表达水平(P<0.05)。2.食管鳞癌细胞株Eca-109的增殖活性及其侵袭迁移能力在S100A7表达水平下调后受到明显抑制且差异具有统计学意义(P<0.05)。3.S100A7表达水平下调导致食管鳞癌细胞株Eca-109的E-cadheirn表达量明显上升,而vimentin和snail表达量显著下降且差异具有统计学意义(P<0.05)。第三部分:S100A7 si-RNA对裸鼠体内食管癌移植瘤的抑制作用方法1.采用食管鳞癌细胞株Eca-109进行裸鼠移植瘤模型构建,随机分为3组并瘤旁注射等量的S100A7 si-RNA、对照si-RNA及PBS观察对移植瘤生长的影响;2.采用Real time-PCR及免疫组化检测瘤旁注射S100A7 si-RNA对移植瘤组织中S100A7、E-cadheirn、vimentin及snail表达水平的影响;结果1.采用瘤旁注射S100A7 si-RNA能够有效抑制移植瘤的生长(P<0.05);2.瘤旁注射S100A7 si-RNA能够明显抑制移植瘤组织中S100A7、vimentin及snail的表达水平,但能提高E-cadheirn的表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.S100A7 m RNA及其蛋白在食管鳞癌组织、癌旁组织及正常食管组织表达量呈现逐级递减的趋势,且在食管鳞癌细胞株Eca-109中也有表达,表明S100A7与食管鳞癌发生发展及侵袭转移有关,可作为食管鳞癌转移及预后的分子标志。2.通过RNAi技术可抑制食管鳞癌细胞株Eca-109中S100A7表达水平,进而抑制食管鳞癌细胞株Eca-109增殖活性及其侵袭迁移能力,结果表明S100A7介导食管鳞状细胞癌侵袭和转移,可能为食管鳞状细胞癌的分子靶向治疗提供理论依据3.裸鼠移植瘤体内研究显示S100A7 si-RNA能够有效抑制瘤体组织内S100A7的表达水平并且抑制肿瘤的生长,表明以S100A7为靶点并通过RNAi技术对食管鳞癌进行靶向治疗具有广阔的临床应用前景。