论文部分内容阅读
目的:本文旨在分离和纯化盐肤木三萜成分（TER）并探讨其通过作用于结直肠癌（CRC）酸性代谢产物以及微环境进而发挥抗结直肠癌作用的机制。方法:将盐肤木根茎的60%乙醇粗提物分别用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇萃取,选择1-20min内出峰最多的部位进一步用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱;MTT法检测各洗脱成分的抗肿瘤效应;MTT法比较正常肠上皮HCoEpiC细胞和结肠癌SW620细胞对TER的敏感性;流式细胞仪检测SW620细胞凋亡情况;同时采用CT26小鼠结肠癌细胞建立小鼠皮下瘤模型,并给予不同浓度的TER处理,以阳性药5-Fu作为对照,测量肿瘤体积并计算抑瘤指数。通过H&E染色、免疫组化染色以及Tunnel染色分析小鼠肿瘤组织,观察TER治疗后的肿瘤组织形态变化、核增殖抗原Ki67的表达以及小鼠体内肿瘤组织凋亡的情况。试剂盒测定SW620细胞的葡萄糖摄取率和乳酸生成率;基质胶侵袭试验测定SW620细胞的侵袭能力;Western blot检测SW620细胞的糖酵解关键酶、H+交换相关蛋白以及酸敏感离子通道（ASIC）家族成员的表达;检测SW620细胞中MMPs蛋白的表达,免疫组化法检测肿瘤组织中MMP-9蛋白的表达;结果:HPLC检测三萜类成分主要存在于二氯甲烷洗脱部位,但杂质较多,主峰不明显,用二氯甲烷-甲醇进一步梯度洗脱后,得到的9号样品1-20 min内出峰分离度较好,主峰明显,含有桦木酸浓度为0.528 mg/mL,桦木酮酸浓度为0.632 mg/mL,将9号样品作为TER进行后续研究。MTT结果显示,TER可以有效抑制HCT116和SW620两种结肠癌细胞的增殖,其抑制HCT116细胞的IC50值为62.27μg/mL,抑制SW620细胞的IC50值为53.31μg/mL。但对正常肠上皮细胞HCoEpiC无显著抑制作用,200μg/mL浓度时的抑制率仅为32%。在体实验结果也表明TER可以有效抑制小鼠肿瘤的生长,H&E染色结果显示TER可以使肿瘤组织出现损伤和坏死,免疫组化实验结果表明TER下调肿瘤组织中核增殖抗原Ki67的表达;流式细胞术结果显示100μg/mL浓度的TER显著促进SW620细胞凋亡,P<0.01,同时Tunnel染色结果显示经不同浓度TER治疗后的小鼠肿瘤组织中凋亡细胞数目增多。TER可以显著抑制SW620细胞的葡萄糖摄取和乳酸生成（100μg/mL浓度时,P<0.001）,并下调糖酵解关键蛋白GLUT1、PKM2和LDHA以及H+交换相关蛋白MCT1和NHE1的表达,同时ASIC2和钙调神经磷酸酶/活化T细胞核因子（NFAT）通路蛋白的表达均被下调。TER处理SW620细胞后,Western blot检测到MMP-2、MMP-9蛋白的表达减少,同时基质胶侵袭试验结果显示SW620细胞的侵袭能力降低;在TER治疗后的小鼠肿瘤组织中观察到MMP-9蛋白的表达被下调。结论:我们的研究结果表明了从盐肤木中提取的TER可以通过靶向CRC酸性微环境并抑制ASIC2诱导的钙调神经磷酸酶/NFAT途径,有效抑制CRC细胞的生长和侵袭,可以作为治疗结直肠癌的辅助疗法。