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目的:获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS）是一种由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）感染诱发的严重危害人类健康和生命的传染病。抗逆转录病毒治疗（Antiretroviral therapy,ART）作为针对HIV感染最有效的治疗方法可以有效抑制病毒复制,重建免疫功能,降低相关并发症的发生率和死亡率。然而有一部分患者在ART治疗后尽管病毒水平得到了有效控制,而CD4+T细胞数量仍未恢复,成为免疫无应答者（Immunological Nonresponder,INR）。目前研究认为免疫恢复不良与骨髓造血减少、胸腺输出不足、异常免疫激活和代谢特征等因素相关,但均不能完全解释其产生机制。而本质上,HIV感染的免疫恢复主要与CD4+T细胞产生减少、消耗增多有关。我们的前期研究发现,与免疫应答者（Immunological Responder,IR）相比,INR患者血浆中7条miRNAs表达量升高并且可作为免疫恢复状态的预测标志物,进一步分析发现miR-16-5p在此过程中可能发挥重要作用。有研究报道miR-15/16家族缺陷的小鼠外周循环中CD4+和CD8+T细胞增殖及产生记忆CD8+T细胞频率更高,而miR-16-5p是否会对HIV感染者T细胞数量和功能产生影响,进而影响ART治疗后免疫恢复,目前尚不清楚。因此本研究拟探索miR-16-5p对T细胞增殖和凋亡情况的影响,并且进一步研究其功能变化的调节机制,明确miR-16-5p在HIV感染者在ART治疗后免疫恢复中的作用。研究方法:本研究选取了31例ART治疗1年以上的HIV感染者。实验方法:1、T细胞转染miR-16-5p mimics:PBMC用磁珠负选T细胞,分别将miRNA Control/miR-16-5p mimics及Lipofectamine RNAi MAX转染试剂溶于RPMI 1640,混匀静止5分钟。将miRNA稀释液与RNAi MAX稀释液混合并静置15分钟,放入24孔板中并加入培养基细胞悬液（不含青链霉素）,置于37℃培养箱中培养40小时,之后可进行转染效率检测或细胞刺激处理。2、T细胞增殖水平的检测:将转染了miRNA的T细胞洗涤并重悬于PBS中,加入Violet荧光染料在37℃摇床孵育30分钟,加入5倍体积完全培养基静置5分钟并洗涤、重悬于新鲜培养基,放入48孔培养板中（0.5 million/500μL）。加入T细胞刺激物CD3/28 beads（beads:细胞=1:4）,继续培养3天。3天后收集细胞,洗涤并加入PE-Cy7-CD3、APC-Cy7-CD4、FITC-CD8荧光抗体在4℃条件下避光染色30分钟。随后洗去多余染料并加入7AAD染色4分钟,使用流式细胞仪检测。3、T细胞凋亡情况的检测:T细胞在完成转染后,加入T细胞刺激物CD3/28 beads（beads:细胞=1:4）,在48孔培养板中以0.5 million/500μL细胞密度继续培养48小时,之后收集细胞并标记PE-Cy7-CD3、APC-Cy7-CD4、APC-CD8表面抗体。加入凋亡染料Annexin V和7AAD并在室温避光染色15分钟,使用流式细胞仪上机检测。4、T细胞钙内流的检测:收集转染后的T细胞并用PBS洗涤,加入LIVE/DEAD染料在4℃避光条件染色15分钟。将钙离子染料Fluo-4、Fura-red与0.02%Pluronic F-127等体积混合后加入到T细胞中,加入RPMI 1640（1 million/m L）在室温染色30分钟,随后染PE-Cy7-CD3、APC-Cy7-CD4、APC-CD8表面抗体,最后用完全培养基洗细胞并重悬于1 m L,使用流式细胞仪上机检测。首先,获取90秒基底荧光信号,之后加入可溶性anti-CD3/anti-CD-28抗体（各10μg/m L）记录300秒激活后的荧光信号,最后加入离子霉素（1μg/m L）继续记录120秒阳性参照信号。5、实时荧光定量检测miRNA表达水平:将转染后T细胞洗涤离心,采用RNeasy Plus Micro KIT试剂盒提取胞内RNA,将得到的RNA使用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit试剂盒逆转录为c DNA。以U6基因为内参,通用TB Green染料法进行实时荧光定量,检测miRNA表达水平。6、转录组测序:将每个HIV感染者T细胞分别转染miR-16-5p mimics及miRNA Control,完成转染后提取胞内总RNA保存至-80℃条件,通过实时荧光定量检测miRNA转染效率并由上海欧易生物有限公司进行转录组测序分析,结果使用DESeq R语言进行差异基因的统计分析。结果:1、在7条microRNA中,miR-16-5p可参与多条细胞生长相关通路。miR-16-5p可作用于7条miRNA共同通路中的多条信号通路,参与Wnt、p53、PI3K-Akt、m TOR、MAPK和细胞周期等重要通路（图1）。2、过表达miR-16-5p后,CD4+和CD8+T细胞增殖下降、凋亡无明显变化。T细胞转染miR-16-5p mimics后,miR-16-5p过表达水平达298倍（图2A）。过表达miR-16-5p后,与对照相比,CD4+、CD8+T细胞增殖水平明显下降（P<0.05,图2B、C、D）,而凋亡情况无显著差异（P>0.05,图3A、B、C）。3、miR-16-5p影响T细胞阳离子转运通路,抑制CACNB2基因表达。通过转录组分析过表达miR-16-5p及对照T细胞的差异表达基因,发现差异基因显著富集于离子转运通路（图4A）,且过表达miR-16-5p的T细胞的钙通道蛋白亚基基因CACNB2表达显著降低（P<0.05,图4B）。4、miR-16-5p抑制CD4+T细胞活化时钙离子内流。过表达miR-16-5p的T细胞与对照相比,CD4+T细胞活化时钙内流明显下降（P<0.05,图5B）,而CD8+T细胞钙内流有下降趋势（P>0.05,图5C）。结论:通过观察过表达miR-16-5p对CD4+、CD8+T细胞增殖和凋亡情况的影响及深入探究,发现miR-16-5p通过影响细胞活化后钙内流过程进而影响T细胞增殖情况,对HIV感染者ART治疗后的免疫恢复产生不良影响。