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危害生殖健康的环境污染物种类较多,重金属是其中之一。汞可以对神经系统、血液系统、消化系统及生殖系统等造成损伤。汞可以在睾丸组织蓄积而影响精子的质量、数量及精子的产生,诱发男性不育症。目的该研究利用成年大鼠睾丸间质细胞(Leydig cell)作为模型,通过观察氯化汞对睾丸间质细胞类固醇激素合成的影响,以进一步探讨无机汞对雄性生殖系统的毒作用机制。方法1.睾丸间质细胞的提取、纯化及鉴定2. Leydig细胞贴壁时间的选择：睾丸间质细胞分别培养2 h、3 h、6 h、12 h、24 h后,收集尚未贴壁的悬浮细胞和培养液转移到新的培养瓶内,加含血清的DMEM/F12培养液继续培养；原培养瓶内的细胞改加无血清培养液继续培养。显微镜下分别观察细胞数目和形态,确定最佳贴壁时间。3. HgCl2对Leydig细胞活性的影响：分别加入含不同浓度HgCl2培养液染毒细胞,采用MTT法,确定染毒剂量。4. Leydig细胞培养上清中孕酮含量的测定：睾丸间质细胞做如下操作：①加入人绒毛膜促性腺激素(HCG)终浓度分别为0.0IU/ml、0.1IU/ml、1.0IU/ml、10.0IU/ml和100.0IU/ml培养液培养4 h后,提取培养上清液,采用放射免疫分析法(RIA)测定孕酮含量；②用10-6mol/L HgCl2和10.0 IU/ml HCG混合染毒细胞,加入10.0IU/ml HCG的作为对照,分别在1 h、2 h、3 h、6 h、12 h、24 h提取培养上清液, RIA测定孕酮含量；③分别加入含10IU/ml HCG的HgCl2浓度为0 mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L的无血清培养基,染毒3 h后,RIA测定上清中孕酮的含量。5. Leydig细胞中StAR、P450scc和3p-HSD mRNA表达水平：分别加入HgCl2终浓度为10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L的无血清培养基,Omol/L剂量组为对照组,染毒3 h后,提取RNA,运用实时定量PCR技术检测HgCl2对Leydig细胞中StAR、P450scc和3β-HSD mRNA表达的影响。结果1.鉴定结果：Leydig细胞活率在90%以上,纯度约为97%,均达到试验要求。2. Leydig细胞贴壁时间的选择和确定：6 h,12 h和24 h组原培养瓶内的细胞数量一致,12 h和24 h原培养瓶内细胞形态一致且较6 h组形态相对混杂,所以确定6 h为最佳贴壁时间。3.MTT结果：10-4mol/L HgCl2抑制细胞的活性(P<0.05)；其他剂量组和对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。4.RIA结果：①在HCG刺激下,睾丸Leydig细胞分离孕酮的量HCG浓度为10IU/ml时最高。因此,选择101U/ml作为HCG的刺激浓度；②染毒组和对照组的Leydig细胞分泌孕酮的量均在6 h到达峰值,且在各时间点混合组的孕酮量均低于对照组,但仅在3 h和12 h两个时间点,两组间的差异有统计学意义(P<0.05)。因为在睾酮生成的过程中,孕酮可以在细胞色素P450 17α-羟化酶(P450c17)作用下转变为其他类固醇激素,故选择染毒时间为3 h。③Leydig细胞经不同浓度HgCl2染毒后,Leydig细胞分泌孕酮的量均有所降低,其中10-7mol/L和10-6mol/L HgCl2染毒组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。5.实时定量PCR结果：10-8mol/L HgCl2剂量组StAR、P450scc和3β-HSDmRNA相对表达量均与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)；而10-5mol/L10-6 mol/L和10-7 mol/L HgCl2剂量组的StAR、P450scc和3β-HSD mRNA相对表达量均明显低于对照组(P<0.05)结论在该实验条件下,HgCl2对原代培养的大鼠睾丸Leydig细胞在10-8mol/L～10-5 mol/L剂量范围对细胞活力没有明显影响,而10-4 mol/L以上剂量的HgCl2对Leydig细胞活性有明显的抑制作用。10-8mol/L～10-5mol/L剂量范围的HgCl2作用于原代培养的大鼠Leydig细胞,StAR、P450scc和3β-HSD基因的mRNA的相对表达量均有所降低,其中10-7～10-5 mol/L剂量组和对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。