热射病(Heat stroke,HS)是一种灾难性热相关性疾病,往往合并多脏器功能障碍需要脏器功能支持治疗。中暑的病死率约为10-15%,一旦发展为多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),病死率可高达40%以上。尽管采取积极的降温和脏器支持措施,死亡率仍居高不下,即便是存活患者,仍有30%以上遗留有长期的神经系统等后遗症。随着全球气候变暖,热浪袭击频率和强度在增加,预计中暑的发病率和病死率将逐年递增。同时,中暑及其并发症的救治需要消耗大量宝贵的卫生资源,给家庭和社会带来沉重的经济负担,迫切需要采取针对性措施提高中暑救治水平。凝血紊乱是重症中暑的显著特征,与严重脓毒症相关凝血功能障碍类似,但其发展较后者更加剧烈和迅速,短时间内可进展为弥散性血管内凝血(disseminated or diffuse intravascular coagulation,DIC)。病理表现以广泛的微血管内纤维蛋白沉积为特征,临床表现为多脏器出血,尤其是脑、肺和胃肠道出血,可直接导致早期死亡,也是发展为终末期脏器功能衰竭的重要机制。因此,深入研究HS凝血紊乱的特点和机制,早期发现并阻断凝血紊乱的进展,是改善HS相关DIC及预后的关键。HS导致的急性凝血紊乱的机制至今尚不清楚,大部分研究倾向于内皮损伤可能是凝血和炎症反应启动并相互作用的起始环节。实际上,不容忽视的是,在内皮的表面和血流之间存在着一层特殊的基质结构即内皮多糖包被(endothelial glycocalyx,EG)。在越来越多的研究中,已经发现,EG具有多种生理调节功能,包括参与了血管通透性、白细胞和血小板粘附、炎症、血流抵抗及凝血等生理过程。而且,从EG的解剖位置和流动性结构看,EG的损伤是内皮损伤的“重要门户”,从其特殊的生理功能推测,EG破坏很可能是导致内皮损伤,放大炎症和凝血激活的起始环节,在HS凝血紊乱中发挥了重要作用。EG的结构主要包括蛋白聚糖、葡糖氨基葡聚糖、及糖蛋白、糖脂和可溶性的血浆分子等。多配体聚糖-1(Syndecan-1)是EG主要的膜蛋白聚糖,透明质酸(hyaluronan,HA)是葡糖氨基葡聚糖的主要成分,二者的血清水平与EG的厚度测量密切相关,是EG损伤的敏感的标记物。目前,关于EG损伤的研究多集中在糖尿病、冠心病以及缺血再灌注损伤等急慢性心血管疾病的血管炎症、通透性调节等方面。在内毒素导致的凝血紊乱及肺损伤方面,亦有人报道了 EG的损伤。而在HS研究方面,尚无关于EG破坏与内皮损伤,及其激活炎症和凝血方面的研究报道。因而,我们的研究假设是,HS首先导致了 EG的破坏,从而进一步导致内皮损伤、炎症放大和凝血激活,最终导致凝血紊乱。本研究从临床和实验室两个水平系统研究内皮细胞多糖包被损伤在中暑凝血紊乱中的作用机制,及其对于中暑患者预后判断的价值。在临床方面,本研究系统回顾性分析临床HS患者凝血紊乱的发生及发展的特征,及其与脏器功能损害和预后的关系,并在此基础上研究HS患者多糖包被血清标记物Syndecan-1和HA对于凝血紊乱早期诊断及预后判断的意义。在实验室方面,本研究从体内和体外两个水平证明热应激对于内皮细胞多糖包被的损害作用,表现在内皮多糖包被的厚度变薄,由此导致固有免疫细胞对于内皮细胞粘附功能的增强和发生炎症反应,在此基础上诱发早期凝血紊乱,对于中暑病人及大鼠的预后有重要影响。本研究进一步通过抗氧化剂干预作用的体内及体外研究,证实内皮细胞多糖包被早期损伤的机制是基于热应激对于内皮细胞氧化应激水平的影响,进而导致内皮粘附功能增强,炎症反应激活及凝血激活。本研究探讨EG损伤对HS凝血紊乱及预后的影响,不仅在热射病救治方面,将对内皮损伤保护的视角进一步提前到EG的保护及内皮损伤的预防,而且可以探索更加有效的方法和标记物早期发现和监测HS相关的凝血紊乱,进行早期预后判断,也为早期干预提供了有效的治疗靶点。一、回顾性研究观察HS患者凝血紊乱的发生率、发生时间分布特点及凝血指标与预后的关系本研究中通过收集2005年6月至2014年10月入住广州军区总医院重症医学科诊断为热射病的患者为研究对象,通过非参数检验分析上述患者凝血指标异常的发生特点,并采用Logistic回归分析,探讨与HS预后相关的凝血指标。结果表明,共纳入93例患者。以ISTH的显性DIC评分作为DIC诊断标准,89例患者进行了 ISTH评分的统计。入院患者显性DIC(ISTH评分≥5分)的发生率为55.06%。以发病24h内入院患者统计,显性DIC的发生率高达65.67%,发病72h后入院的患者中,仍有33.33%的患者合并显性DIC。与超过24h入院患者显性DIC阳性率比较,发病至入院24h内显性DIC的阳性率差异有统计学意义(65.7%vs 22.72%,χ2=12.747,P=0.002)。从凝血指标异常的发病时间分布分析,PT异常在发病24h内阳性率为42.65%,24-48h阳性率为85.71%,48-72h阳性率为75.00%,72h后阳性率为58.33%;APTT异常的阳性率在发病 24h 内、24-48h、48-72h、72h 后分别为 35.29%,85.71%,75.00%,41.67%;二项指标异常的阳性率最高均出现在发病后24-48h。FIB异常的阳性率在各时间段分布为6.06%,28.57%,33.33%和16.67%,D-Dimer异常的阳性率在各时间段分布分别为74.00%,100%,100%和71.43%。PLT异常的阳性率在各时间段分别为68.57%,28.57%,0.00%,33.33%,在24h内发生率最高;全血凝血监测仪Sonoclot指标ACT代表的凝血紊乱的意义与PT和APTT相对应,其发病24h内指标异常阳性率为61.54%,超过PT和APTT异常的阳性率。CR代表纤维蛋白原的转化速率,与传统的凝血指标FIB对应,其发病24h内异常阳性率为33.33%,高于FIB。本研究中,合并显性DIC的HS患者死亡率明显高于未合并显性DIC患者的死亡率(P=0.000)。同时,ISTH评分与患者APACHEII评分呈显著正相关(r=0.745,P=0.000)。Logistic模型进行分析,显示D-Dimer和ACT与死亡结局有一定的相关性,优势比(odds ratio,OR)为 1.061(95%CI:0.990-1.137)和 1.009(95%CI:1.000-1.018)。二、初步探讨血清多糖包被标记物Syndecan-1和HA与HS患者凝血紊乱及预后的关系根据实验设计,纳入2013年6月至2014年10月入住广州军区总医院重症医学科诊断为热射病,且发病12h内入院的患者为研究对象。共16名患者符合入选标准,因入选患者均为男性,故选择11例男性健康正常人作为对照组。探索性分析内皮多糖包被标记物Syndecan-1和HA与HS患者凝血紊乱及预后的关系。结果显示,血清 HA(r=0.831,P=0.000)及 Syndecan-1(r=0.788,P=0.000)水平分别与患者DIC评分呈显著正相关。对上述患者入院时的内皮、凝血及纤溶激活标记物TM、TAT及PAP等常规指标也进行了相关性分析,发现入选患者仅入院时TAT水平与DIC评分呈显著正相关(r=0.722,P=0.002),而入院血清 TM(r=0.243,P=0.365)、PAP(r=0.478,P=0.061)水平与 HS 患者 DIC 评分无显著相关关系。血清HA及Syndecan-1与预后的关系的分析显示,与健康对照组((37.73±11.03)ng/ml,(278.24±216.29)ng/ml))比较,HS组患者血清HA 水平(217.90±138.22)ng/ml 及 Syndecan-1 水平(2976.85±1624.21)ng/ml显著升高(P<0.001);合并MODS的HS患者,血清HA水平及Syndecan-1水平较未合并MODS的HS患者显著升高(P=0.000);与存活组比较,HS患者死亡组中血清HA水平及Syndecan-1水平均显著升高(P=0.000,P=0.014);血清 HA(r=0.837,P=0.000)及 Syndecan-1(r=0.787,P=0.000)水平分别与患者APACHEII评分呈显著正相关。通过ROC曲线评价血清HA及Syndecan-1水平对死亡的判断价值,结果表明,血清HA>281.7ng/ml为最佳诊断界点,其敏感性、特异性分别为100%、100%,ROC曲线下总面积为1.00(P=0.001);血清Syndecan-1>3215ug/ml为最佳诊断界点,其敏感性、特异性分别为100%、90%,ROC曲线下总面积为0.90(P=0.009)。三、内皮多糖包被在热射病大鼠凝血紊乱中的作用及预后价值的实验研究1.热射病大鼠各凝血指标、凝血标记物、EG损伤标记物血清HA及Syndecan-1水平时程变化的特点和关系为完整地展示HS大鼠凝血动态变化的特点,本研究将实验大鼠随机分为正常对照组(C组,n=6)、热打击组(根据预实验结果,设置41℃、42℃、43℃、HS-0h、2h、6h、24h、48h、72h和216h温度梯度和时间亚组,各亚组n=6),观察大鼠各时间点各项凝血指标、凝血标记物及EG标记物的变化及相关性。结果显示:自大鼠核心体温达41℃开始,APPT和PT逐步较正常组延长。43°C时,APTT延长显著高于正常对照组(P<0.05);HS-Oh组,PT值显著高于正常对照组(P<0.05),二者均在HS-24h达到检测范围的最高值,较正常组显著延长(P<0.01)。FIB和PLT早期变化不显著,均在HS发生后24h较正常值显著降低(P<0.01)。HS发生后72h,各项指标逐步恢复。HS-0h时,ACT值与正常值比较无显著差异(P>0.05),HS发生后2h后,ACT显著延长,24h达到最高峰(P<0.01),高于检测范围的最高值,72h恢复正常。但是,在体温达43°C时,CR值已经较正常显著升高(P<0.05),在HS发生时,CR值又下降到正常参考水平,但与正常值无显著性差异(P>0.05)。HS-2h、6h和24h时,CR逐步下降,与正常对照值比较均有显著差异(均P<0.05),24h最低,72h恢复正常;自大鼠体温升高至43°C开始,PF值较正常进行性下降(P<0.05),至24h时低至无法测出,72h恢复正常。大鼠多糖包被血清标记物HA及Syndecan-1水平在HS发生时即明显升高(P<0.01),24h达到高峰,分别在72h和216h恢复正常水平(P>0.05),二者变化趋势、达峰时间与上述凝血指标变化基本一致,尤其是早期升高的时间点是同步的。HS大鼠凝血标记物凝血酶抗凝血酶复合物(TAT)、纤溶酶-抗纤溶酶复合物(PAP)及内皮损伤标记物血管性血友病因子(vWF)和内皮素-1(ET-1),在HS发生Oh较正常对照组均无显著升高(P>0.05),分别在HS发生后2h或6h才出现显著的升高(P<0.01),达峰值和恢复的时间与凝血指标基本一致。2.NAC对HS大鼠内皮多糖包被损伤及炎症-凝血紊乱的影响为进一步证实EG在凝血紊乱中的作用,本实验选择NAC进行干预,以通过预防性给予NAC抗氧化保护EG,观察热应激后对凝血紊乱的保护作用。将实验大鼠随机分为正常对照组(n=6)、热射病组(HS组,n=6)、N-乙酰半胱氨酸治疗组+HS(NAC+HS组,n=6),于HS发生后2h观察各项指标的变化。结果显示,电镜下,正常对照组大鼠肺毛细血管内皮多糖包被完整,而HS组多糖包被厚度显著减低,伴EG断裂。予以NAC干预后,多糖包被损伤明显减轻。激光共聚焦荧光免疫检测大鼠肺组织血管内皮Syndecan-1的表达,在HS组表达显著减少(P<0.05),而予以NAC干预后Syndecan-1的表达与正常对照组无显著差异(P>0.05);同时,与对照组比较,HS组大鼠血清HA表达显著增高(152.06±36.47 vs 81.25±19.26,P=0.002);NAC+HS 组较 HS 组血清 HA 表达显著降低(102.50±6.26 vs 152.06±36.47,P=0.025)。予以 NAC提前干预的HS大鼠,凝血指标包括PT、APTT、ACT、CR及PF异常均较HS组明显改善(均P=0.000);血清IL-6表达较HS组显著降低(109.41±9.63vs 221.16±22.91,P=0.000),TNF-a水平升高的程度较HS组轻度下降,但无显著性差异(102.50±36.46 vs 127.52±38.43,P=0.500)。3.EG损伤标记物血清HA及Syndecan-1与HS大鼠预后的关系在预后价值研究中,取40只大鼠,以血压峰值下降开始作为热射病大鼠复制成功标记,复制热射病大鼠模型,模型复制成功后,立即予以抽血检测内皮多糖标记物血清HA及Syndecan-1水平。经排除模型复制及采血因素导致死亡的大鼠后,22只大鼠纳入研究。根据结局分为死亡组和存活组,死亡组12只,存活组10只,总体死亡率为54.55%,观察EG标记物HA及Syndecan-1对HS大鼠预后的判断价值。结果显示,与生存组比较,死亡组大鼠HA及Syndecan-1 水平显著增高(2.29±1.36 VS 0.20±0.15,P=0.000),(197.25±61.34 FS13.47±3.87,P=0.000)(图 2-12,表 2-4)。四、内皮多糖包被损伤对内皮细胞粘附功能的影响为进一步证实多糖包被在凝血紊乱中的作用及其可能的损伤机制,我们在体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),根据处理因素不同分为对照组、热打击组、H2O2刺激组及N-乙酰半胱氨酸干预组,通过透射电镜观察内皮细胞EG的厚度、内皮-白细胞粘附实验及粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)检测,观察不同处置下多糖包被的变化、内皮细胞粘附功能的改变。结果显示,电镜下可见,热打击组((0.33±0.13)um 和 H202刺激组((0.52±0.13)um)HUVEC 多糖包被厚度与正常对照组((1.53±0.17)um)比较显著减少(均P=0.000),而NAC组多糖包被减少程度明显减轻((1.40±0.17)um),与对照组无显著差异(P=0.385)(图2-13)。内皮细胞-白细胞粘附实验显示,各处理组间THP-1粘附细胞数有显著性差异(P=0.000)。与对照组THP-1粘附细胞数((0.55±0.22)×104)比较,((3.06±1.18)×104)THP-1粘附数显著增多(P=0.000)。H202组粘附细胞数与热打击组比较无显著差异(((2.82±0.76)×104)vs((3.06±1.18)×104))(P=0.940);NAC组THP-1白细胞粘附的细胞数((0.74±0.30)×104)较热打击组显著下降(P=0.000)。(图2-14)。与对照组比较,热打击导致内皮细胞释放ICAM-1、VCAM-1显著增加(P<0.05)。同样,H202刺激组培养液上清ICAM-1、VCAM-1的浓度显著增高(P<0.05)。NAC治疗组培养液上清ICAM-1、VCAM-1浓度无显著增加(P>0.05)。通过以上研究,我们得出以下结1.HS患者DIC发生率高,显性DIC的总体发生率为55.06%,发病24h内入院患者中,显性DIC的发生率高达65.67%,发病24h后显性DIC的发病率为22.73%。一旦合并DIC,患者死亡率明显增高。2.HS患者24h内早期的Sonoclot分析仪凝血指标ACT及CR异常的阳性率高于传统凝血指标APTT、PT及FIB,且ACT及D-Dimer是HS死亡的独立危险因素,可能提示Sonoclot分析仪指标ACT及CR较传统指标更加敏感,联合D-Dimer可能对预后有重要判断价值。3.HS患者血清HA及Syndecan-1水平可能与HS凝血紊乱关系密切,并对预后有判断价值。4.HS大鼠凝血指标的异常发生在核心体温上升期,而HS发生后,HS大鼠出现了进展的凝血紊乱,24h达到高峰,72h逐步恢复。提示HS大鼠的凝血激活是HS发生过程的极早期事件,可能是HS进展的重要机制,需早期重视和干预。5.HS大鼠肺血管内皮细胞多糖包被的减少与凝血指标的异常密切相关,通过予以NAC保护EG,可以减轻内皮损伤、炎症反应和改善凝血指标,说明EG可能通过氧化应激损伤,导致内皮损伤和炎症反应加重,进一步引起凝血紊乱和 DIC。6.通过热打击导致人脐静脉内皮细胞(HUVEC)使EG明显减少,内皮细胞-白细胞粘附功能增加,细胞培养上清ICAM-1及VCAM-1表达显著增多,予以NAC干预后,EG损伤减轻,内皮细胞-白细胞粘附减少,细胞培养上清ICAM-1及VACAM-1表达减少。提示EG损伤导致凝血紊乱的重要机制可能是通过影响了内皮的粘附功能实现的。7.内皮多糖包被可能是HS早期内皮保护和改善凝血紊乱的新的治疗靶点。