药物代谢是药物在体内消除的主要决定因素。药物在体内代谢向两个方向发展：代谢解毒和代谢活化，其中大部分药物的代谢在肝脏进行。细胞色素(CYP450)酶系是肝脏中主要的代谢酶系，其中CYP3A4是细胞色素P450系统的重要亚型，占肝脏中P450酶总含量的25％，临床上50％的药物通过此酶代谢而排出体外。临床实践中发现，大多通过CYP3A4．代谢的药物都存在显著的个体差异和种族差异，这对于治疗窗窄、安全指数低的药物很易发生药物毒性反应和达不到疗效。并且绝大部分药物因需要长期应用和合并用药，常发生自身代谢诱导，即随着药物应用时间和剂量的增加，药物在体内的代谢增强，从而需不断加大用药剂量。但不同患者增加强度不同。 近年来一系列研究发现，人孕烷X受体(human pregnane X receptor, hPXR)作为关键的转录调控因子参与CYP3A4基因诱导表达。hPXR可以被许多临床药物激活，包括钙通道拮抗剂、抑制素、降糖药、HIV蛋白酶抑制剂、抗激素药、抗癌药，这些药物的大多数都是依赖CYP3A4代谢而排出体外的。hPXR基因已进行了功能研究的29个SNP中，发生在编码区的11个SNP有7个可引起hPXR蛋白序列的差异，经细胞重组表达研究显示出利福平诱导CYP3A4转录活化的差异；另外，在3，端和5’端非编码区及近端内含子的18个SNP中，经细胞重组表达研究已明确有8个SNP影响药物代谢酶CYP3A4的转录表达。 目的： 第一部分hPXR基因SNP检测及单倍型分析 在中国健康汉族人群中广泛筛查hPXR基因的SNP，明确其单倍型分布，并与其它种族比较，明确种族差异。 方法： 用PCR-直接测序法对hPXR基因的编码区、近端内含子、3’及5'-UTR的SNP进行广泛筛查，计算各SNP频率，并验证是否符合Hardy—Weinberg平衡。与其它种族比较SNP频率差别采用x<'2>检验。PHASE V.2.1进行单倍型分析。 结论： 中国健康汉族人群发现16种SNP，其中未见报道的新SNP有2个(-25439A>G和7637C>T)；有9个为在NCBI的SNP数据库中直接登陆而未经确证的SNP(其中两个位于hPXR基因启动子的关键部位，本研究将在第二部分对这两个突变的功能进行进一步的研究)；另外，本试验发现的SNP的种类，频率和常见的单倍型的种类与已报道的其它种族存在显著性差异。 目的： 第二部分 hPXR启动子区域的突变-24622A>T 与-24446C>A的功能研究 第一部分试验中在hPxR基因启动子的关键调控区域发现一24622A>T及一24446C>A两个突变，发生频率分别为3.5％及2.4％，前者在美国黑人中有报道(发生率3.1％)，后者仅见于亚洲人群(发生率3.6％)，在高加索人和美国黑人中未见报道。鉴于此两突变所处位置，推测可能会影响hPXR自身表达，从而影响受hPXR调控的下游基因的转录与表达。用报告基因的方法检测这两个突变对hPxR启动子功能的影响。 方法： 通过构建三种1.2kPxR—pGL3—Basic表达质粒(T—24622T—pGL3、A-24446A—pGL3与靶片段无突变—pGL3)，以pGL3重组质粒与phRL—CMV共转染HepG2细胞，考察一24622A>T及—24446C>A对PXR自身表达的影响。t-检验进行统计学评价，P<0.05有统计学意义。 结论： 这两个发生于hPXR基因启动子关键区域的SNP-24622A>T与-24446C>A使PXR自身转录活性增强。 第三部分 CYP3A4底物硝苯地平的质谱检测方法的建立与确认 目的： 硝苯地平经CYP3A4代谢，因而常用作探针药反应CYP3A4代谢活性。本实验将在第四部分考察hPXR的不同单倍型对与CYP3A4代谢表型的关系，将以硝苯地平为探药。故先建立硝苯地平及其代谢物氧化硝苯地平的质谱检测方法，并进行验证，为下一步检测受试者血浆中硝苯地平及氧化硝苯地平浓度，从而反应相应的CYP3A4活性奠定基础。 方法： 1．建立硝苯地平及其代谢物氧化硝苯地平检测的质谱方法、液相方法及血浆样本的萃取方法。 2．进行全面的方法学验证：包括方法的精密度、准确度、线性及最低检测限、稳定性及基质效应等。 结果： 1．建立了硝苯地平及其代谢物氧化硝苯地平的LC/MS/MS的检测方法。萃取方法以尼群地平为内标，以无水乙醚：正己烷(3:1，v/v)为萃取剂。质谱条件为：离子源EST，正离子扫描及选择反应监测模式(SRM)，监测离子为：m/z 347.1→315.0(硝苯地平)，m/z 345.1→248.3(氧化硝苯地平)及m/z 361.0→315.0(内标)。液相条件：分离柱Hypersil BDS C18(150 mm×2.1 mm，i.d.，3μm，Elite HPLC，China)、流动相为甲醇—水(80:20，v/v)(0.1％甲酸)，流速200μl/min。色谱保留时间为2.5分钟。 2．方法学验证：硝苯地平及氧化硝苯地平的线性范围均为0.5-100 ng/ml。两者的萃取回收率分别为81.3-89.1％和71.6-80.4％，两者的日内及日间精密度、准确度、稳定性的RSD及偏离度均小于15％，符合生物样本检测的要求。结论：建立了LC/MS/MS方法检测人血浆中硝苯地平及氧化硝苯地平浓度，方法精密度、准确度好，灵敏度高，适用于人体药动学研究。 目的： 本实验主要考察hPXR诱导剂SJW(St John’s Wort，金丝桃素制剂)应用前后，hPxR的不同单倍型对与CYP3A4代谢表型的相关性，同时也考察了SNP-24622A>T和-24446C>A与CYP3A4代谢表型的相关性，为明确hPXR单倍型与CYP3A4药物代谢表型间的关系，为探讨CYP3A4代谢表型个体差异的原因提供试验依据；最终为临床用药个体化提供理论指导。 方法： 1.以本试验人群中最常见的两种单倍型组成的三种单倍型对为研究对象，挑选10例受试者进入药动学试验研究。(4人hapl&1，3人hapl&2和3人hap2&2) 2.对上述所选受试者的CYP3A4的基因型进行检测，保证进入药动学研究的受试者CYP3A4的基因型一致。 3.试验为双周期自身对照，受试者服用SJW片剂每日三次，每次300mg。试验前后的CYP3A4活性用硝苯地平及其代谢物的AUC以及两者的比值表示。硝苯地平及其代谢物的血药浓度用LC/MS/MS检测。4.试验数据通过mean±SD表示，采用秩和非参数统计检验，P＜0.05认为具有显著意义。结果： 1．Hapl&1，Hapl&2和Hap2&2组中硝苯地平的药动学特点 在服用诱导剂SJW前后，所有受试者硝苯地平的AUC均显著下降，相应地，对于代谢物氧化硝苯地平，AUC均显著升高，经t-检验，试验前后的改变有统计学意义(P＜0.05)，表明PXR被SJW诱导后，使CYP3A4的转录表达增强，其底物(硝苯地平)的代谢加速，同文献报道一致。 2．Hapl&2组中有与无突变-24622A>T对硝苯地平人体药动学的影响 在Hapl&2组中，两名受试者具有突变-24622A>T，而两名受试者无此突变。无论有无-24622A>T突变，受试者服用诱导剂后，硝苯地平的AUC均下降约40％～45％；但代谢物AUC的升高却因有无-24622A>T突变而有差异，无-24622A>T突变的受试者代谢物AUC升高33.8％，而有-24622A>T的受试者代谢物AUC仅升高11.3％。不过经秩和检验，差异无统计学意义。因而，该突变是否会对PXR的转录激活作用造成影响，还需进一步研究。 3．Hap7&1l组中有与无突变-24446C>A对硝苯地平人体药动学的影响 在第二部分实验中，我们运用报告基因的方法发现突变-24446C>A使PXR自身表达显著增强，推测其可能使PxR对下游基因的转录调控作用增强。因而我们利用人体药动学试验对其进行初步验证。不过，受试者的选择非常困难，因为要保证入选的受试者的hPXR单倍型组成必须一致，但具有突变-24446C>A的7个健康志愿者中，其相互间的单倍型组成差异很大，很难找到阴性对照，最终只入选了两例受试者，单倍型组成为Hap7&ll，一个有-24446C>A突变，一个无此突变。 结论： 1．在中国人群常见的两种hPXR基因单倍型组成的三种单倍型对中(Hapl＆1，Hapl＆2和Hap2&2)，Hap1&1对CYP3A4的基础转录激活作用最弱，诱导转录激活作用最强。 2．单倍型组成Hap7＆11的hF)XR对肠道P—gp及CYP3A4的诱导转录激活作用强于Hap1＆1，Hap1＆2和Hap2&2。 3．位于启动子关键调控序列的突变-24622A>T与-24446C>A可能使PXR自身表达增强，从而使PXR对肠道P—gp及CYP3A4的转录调控作用强于无突变类型，不过因受试者少，需进一步研究确证。