【摘 要】
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微管由交替出现的α微管蛋白和β微管蛋白组成,微管蛋白β-2b链(tubulin beta-2B chain,TUBB2B)是β微管蛋白的亚型基因,它是微管的主要成分。微管蛋白基因TUBB2B的突变会改变微管的正常功能和结构。研究发现TUBB2B蛋白第247位点天冬酰胺突变为丝氨酸会导致小鼠大脑皮质的损坏和异常发育,本文就TUBB2B突变基因TUBB2B(N247S)对微管聚合的影响展开分析。本实验
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微管由交替出现的α微管蛋白和β微管蛋白组成,微管蛋白β-2b链(tubulin beta-2B chain,TUBB2B)是β微管蛋白的亚型基因,它是微管的主要成分。微管蛋白基因TUBB2B的突变会改变微管的正常功能和结构。研究发现TUBB2B蛋白第247位点天冬酰胺突变为丝氨酸会导致小鼠大脑皮质的损坏和异常发育,本文就TUBB2B突变基因TUBB2B(N247S)对微管聚合的影响展开分析。本实验以C57bl/6j小鼠总RNA为模板,反转录得到cDNA,通过与T载体连接构建了TUBB2B基因克隆载体,并通过点突变技术构建了TUBB2B(N247S)基因克隆载体。使用DNA限制性酶切技术构建了TUBB2B(N247S)-p3-flag-cmv-10真核表达载体,并在转染试剂的介导下,将真核重组表达载体及空载体转染至小鼠成纤维细胞L929中,设置空白组和对照组,对不同组的细胞进行微管蛋白的提取,通过Western-blot技术对α微管蛋白表达量进行分析,收集表达的突变蛋白并通过磁分离技术进行纯化,为了研究突变蛋白对微管骨架的影响,对纯化后的突变蛋白进行体外聚合实验分析,所得结果如下:1.构建的TUBB2B以及TUBB2B(N247S)克隆载体经菌液PCR及DNA鉴定证明克隆载体构建正确。2.目的片段与真核表达载体连接成功,并通过菌液PCR,双酶切及DNA测序结果鉴定,成功构建TUBB2B(N247S)-p3-flag-cmv-10真核重组表达载体。3.成功转染L929细胞,以及成功表达突变蛋白,经过优化诱导表达条件,确定了以6孔板为准,最佳目的基因与转染试剂的比例为8:1,且实现了TUBB2B基因在L929中的高效表达。4.转染组与空白组及对照组进行比较,游离态的α微管蛋白显著高于对照组和空白组(P值分别为0.0001和0.0004),聚合态的α微管蛋白显著低于对照组和空白组(P值分别为0.0004和0.0036)。5.磁分离技术纯化可以得到较高浓度的目的蛋白。6.TUBB2B(N247S)突变蛋白对微管蛋白体外聚合具有一定的抑制作用。
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