耐药细菌(antibiotic-resistance bacteria,ARB)的出现、繁殖、传播已经对全球范围内的人类公共健康造成了极大的威胁。一般来说,ARB的出现主要是通过两个途径,一个是临床中大量抗生素的使用从而不断诱导筛选出对抗生素具有抗性的细菌突变株;另一个是通过水平转移或垂直转移的方式获取特定的耐药基因(antibiotic-resistance genes,ARGs)来获得耐药性。目前,大量的关于ARB的发展进化研究局限在临床和微生物群落水平。然而,在自然环境过程中,细菌在残留抗生素的暴露下也能够不断的进化并导致ARB的富集。此外,环境中除了有不同浓度抗生素的诱导作用外,细菌还会受到其他一系列的不利于其生存或潜在的致死性刺激,例如光、热、营养贫乏、金属离子等。细菌在遇到这些刺激因素后会激发其自身的应激系统来改变细菌的基因表达模式和生理状态,从而使得细菌对外界刺激产生一定的耐受性。同时,细菌应激的出现和生理状态的改变往往也与其耐药性的发展可能有着密切的关系。因此,本研究旨在揭示ARB在光和矿物共存的光催化(photocatalytic,PC)界面下出现了哪些损伤以及细菌如何应激反馈,进一步我们将阐明其后续的耐药性发展、持留、传播和遗传等相关问题。(1)首先对细菌在PC刺激下的损伤进行了分析。通过人工培养的方式获取耐药大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)生物被膜(biofilm,BF),将其暴露在PC刺激下,通过流式细胞仪和激光共聚焦荧光显微镜来观察细菌活力的变化,并对损伤过程中细菌的运动性进行测定,分析BF结构的破坏程度。此外,对细菌的胞外聚合物(extracellular polymeric substance,EPS)含量进行分析。进一步,对细菌的群体感应效应和BF的屏障能力进行测定。结果显示BF在受到PC刺激4.5 h后约有30%的细菌被灭活。通过游泳琼脂上细菌的生长轨迹也可以看出BF的运动性也开始明显增加,说明BF的膜属性在逐渐的被消除。与此相对应的是游离的细菌数量在受到PC刺激后出现了数量上的增加。通过群体感应分析也可以看出PC刺激能够明显的消除了 BF中的群体感应现象。此外,BF对于荧光染料的穿透屏障也逐渐削弱。上述结果可以得出BF在受到PC的刺激后会出现明显的活力损伤及膜属性的消除。(2)进一步从基因、蛋白、生理生化的角度建立一套完整的表征方法去了解细菌个体在PC刺激界面下出现的一系列变化。通过基因表达差异分析细菌产生的应激反应(包括氧化应激、胞膜应激、SOS应激、营养胁迫等),并根据细菌胞内的活性氧物种(reactive oxygen species,ROSs)和抗氧化性酶如过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等的活力水平变化分析细菌受到PC刺激后出现的酶应激以及维持氧化还原平衡能力的变化。此外,通过扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察细菌形态的变化来分析细菌的受损程度。进一步,对比PC刺激和抗生素刺激下细菌的一系列变化,分析两种情况下存在差异及相关性。结果显示细菌在受到PC刺激后胞内的ROSs水平和CAT、SOD酶活力出现了明显的上升,表明细菌出现了明显的氧化损伤。此外,在长时间的PC刺激后,细菌的形态结构开始出现破裂。然而,在30 min的诱导期之内细菌依然可以对耐受PC的损伤作用并做出多种应激反应,如氧化应激、胞膜应激等。值得注意的是,PC刺激下的细菌应激与抗生素刺激下细菌产生的应激是相类似的,这说明了 PC刺激和细菌耐药性之间存在潜在关联。(3)通过上一部分的研究,发现了 PC刺激和细菌耐药性之间存在潜在联系。这里进一步采取长期PC刺激诱导以及PC与抗生素交叉刺激诱导的方式,探明细菌在交叉刺激下发展进化的过程中是否出现耐药性的变化以及变化的程度。并对细菌的抗生素耐受性、突变率、抗生素外排泵及BF形成等相关应激状态进行测定,从机制上解释细菌在PC刺激下的耐药性变化规律。结果显示在经过PC的预先刺激之后,细菌的耐药性并没有出现任何的变化。但是,抗生素杀灭99%的细菌所需要的时间(minimun duration kill 99%of bacteria,MDK99)出现 了明显的提高,其中粘菌素(polymyxin,PB)的杀灭时间从 30 min 提高至 150 min、四环素(tetracycline,TET)从 55 min提高至135 min、环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)从14 min提高至40 min、链霉素(streptomycin,SM)从 22 min 提高至 35 min、阿奇霉素(azithromycin,AZI)从 29 min 提高至45 min。此外,细菌的突变率也出现了 3～5倍的提高,其外排泵也出现过量的表达使得在细菌胞内富集的抗生素含量明显下降,局部区域也有BF的出现,这些状态的变化均说明细菌对抗生素刺激具有了更强的耐受性。进一步经过交叉诱导后,可以看出受到PC预先刺激的细菌能够更快更好的适应抗生素刺激,并能够更加快速的发展特定药物的耐药性,其中最小抑菌浓度(minimum inhibition concentration,MIC)分别提高了 32 倍(PB)、32 倍(TET)、16 倍(SM)、4 倍(AZI)。(4)在了解了 ARB在PC刺激下的耐药水平发展变化情况之后,进一步对比研究了 PC刺激和正常的培养基条件下ARB在菌群中的持留情况是否出现差异。分别利用突变和质粒介导ARB与易感细菌(antibiotic-susceptible bacteria,ASB)在PC和正常培养基条件下进行竞争性生长试验,观察ARB在长期的竞争试验中,是如何逐渐被抗生素ASB竞争消除的,并对比不同竞争条件下的差异。此外,对PC刺激下ARB适应性代价、生长速率、代谢速率以及氧化应激等也进行了测定,从而在机制上解释PC刺激如何影响ARB在环境中的持留情况。结果显示,在有PC刺激存在的条件下,耐药突变菌株能够比在正常LB(Luria-Bertani)培养条件下持留更长的时间(6～7天)。对于ARGs介导的ARB而言,PC诱导条件下,细菌群落中的头孢噻肟耐药(ctx-1)基因的平均拷贝数维持在0.38,粘菌素耐(mcr-1)基因的平均拷贝数维持在0.58。相比较而言,在正常LB培养条件下,ctx-1基因的平均拷贝数下降到0.29,mcr-1基因的平均拷贝数下降到0.45。此外,相较于正常的LB培养条件,在有PC刺激条件下,ARB相较于ASB的生长竞争性也更高一些。同时,在PC刺激条件下,ARB的适应性代价相较于LB条件下也明显的减少,说明ARB在PC刺激条件下有比ASB更强的适应性。这也会导致ARB更长时间的在环境体系下持留。这里可以得出PC刺激不仅能够激发细菌的应激反应,还可以降低ARB的适应性代价,从而加速ARB在环境体系中的持留。(5)在了解了 ARB的发展和持留问题之后,进一步对ARB的传播和遗传稳定性进行了相应的研究。为此,通过载体克隆的方式将含有单一 ARGs的质粒导入到菌株E.coli DH5α 中构建了几种不同的 ARB,包括E.coli DH5α(ctx)、E.coli DH5α(pb)、E.coli DH5α(gem)、E.coli DH5α(kan)、E.coli DH5α(tet)。随后进行长期的 PC 刺激,并观察了 ARGs在各个细菌之间的水平转移情况、细菌群落耐药性水平及多样性的变化、不同ARGs丰度的变化以及ARGs序列稳定性的变化等。结果显示,在经过一天的LB或PC刺激之后,通过接合转移的方式,发现细菌群落中出现了双重耐药菌、三重耐药菌、四重耐药菌以及五重耐药菌。此外,随着培养的进行,大部分多重耐药菌开始逐渐被消除,直到30天后超过90%的ARB丢弃ARGs质粒转变成ASB。在此过程中,PC刺激对群落中的ARB数量和多样性均有明显的削减作用。最后,在剩余的ARB中,双重耐药菌为主导ARB占比达99%。不同ARGs丰度的变化出现不同的情况,其中庆大霉素耐药基因(gem)和四环素耐药基因(tet)有下降趋势,而卡那霉素耐药基因(kan)却出现上升,头孢噻肟耐药基因(ctx)和粘菌素耐药基因(pb)没有明显的变化。进一步,发现细菌群落对不同抗生素耐药性变化趋势和ARGs丰度的变化呈现一致。此外,没有明显丰度变化的ctx、kan、pb均出现了一些点突变。这里可以看出PC刺激能够对复杂的ARB群落产生结构和耐药性水平的影响,但是针对不同ARGs存在不同方向的影响。综上,本研究从ARB的损伤、发展、持留、传播和遗传稳定性等几个方面全面的阐明了 PC刺激对于ARB发展和归趋的影响。本论文为了解ARB在环境过程中的一系列发展变化提供了更为深入和全面的信息,同时为耐药性问题的解决提供一定的指导作用。