背景中枢神经系统损伤后无法恢复原有功能的主要原因是轴突再生障碍,轴突再生困难一方面是由于缺乏轴突生长和导向的生长促进因子,另一方面是细胞微环境的抑制性改变,最近的研究表明轴突导向分子也参与成年轴突再生。Eph受体酪氨酸激酶家族及其配体ephrins是一种重要的轴突导向分子家族,参与神经系统生长发育期的轴突导向,其在成年中枢神经系统中继续表达,通常维持在低水平,但当神经系统损伤如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞活化时出现上调,表达上调直接抑制轴突再生,另外,Ephs和ephrins还可以调控胶质增生和胶质疤痕的形成,也可影响成年神经干细胞的增殖、分化和迁移,所以Eph/ephrin信号系统不止通过一种机制影响中枢神经系统再生和功能恢复,而调节Ephs和ephrins表达及其信号系统对成年中枢神经系统损伤后再生至关重要,通过对ephrin/Eph的调控,可能对脑卒中等中枢神经系统疾病的治疗和康复产生重要影响。中枢神经系统损伤或发生神经退行性疾病后,炎症反应非常明显,星形胶质细胞显著激活,产生一系列炎性因子、趋化因子和营养因子等,在神经元的发育和存活、轴突的再生、神经干细胞的分化等过程中发挥重要作用。研究表明损伤后炎症反应可能改变Ephs和ephrins表达,炎症因子的变化可能与Ephs和ephrins表达有关。EphA4广泛分布在大脑神经元上,多种研究表明其在中枢神经系损伤修复中起负向调节作用,ephrinA3是Eph受体的配体之一,存在于星形胶质细胞的ephrinA3配体对维持EphA4活化和树突棘正常形态起着重要作用。本实验就是基于上述研究用脂多糖建立炎症模型,观察脂多糖对星形胶质细胞的影响,探讨炎症损伤后的ephrinA3的变化以及这种变化与炎症反应的关系。目的1.分离、培养和纯化大鼠大脑皮层星形胶质细胞。2.探讨脂多糖对体外培养的星形胶质细胞增殖的影响和ephrinA3在其中的表达变化及其可能机制。方法1.选择出生在24h以内的新生Wistar大鼠为实验动物,分离、培养其大脑皮层星形胶质细胞并纯化。2.倒置相差显微镜下观察星形胶质细胞的生长情况和形态变化。3.应用免疫组织化学染色鉴定星形胶质细胞特异性标志物GFAP表达和ephrinA3在星形胶质细胞上的表达,并对第三代星形胶质细胞进行纯度测定。4.取第三代细胞用于实验,随机分为对照组和实验组,实验组用脂多糖10mg/L干预后随机分为30min干预组、6h干预组、24h干预组、48h干预组和72h干预组。5.MTT法测定各组星形胶质细胞的存活率。6. AO/EB荧光染色检测各组星形胶质细胞的凋亡率。7.CY3荧光染色测定各组星形胶质细胞上GFAP和ephrinA3的表达。8. ELISA法检测各组星形胶质细胞培养液中TNF-a和IL-6的含量。9.用SPSS13.0统计软件分析所得数据,所有数据均以均数±标准差(x±S)表示,经方差齐性检验后,多组均数比较采用单因素方差分析(ANOVA),组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。检验水准为α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.倒置相差显微镜下可见随着培养时间的延长,星形胶质细胞胞体逐渐增大,突起逐渐变长,形态变得逐渐分明,经纯化培养后,星形胶质细胞形态逐渐变得单一,呈梭形或星形,胞体明显,境界清楚。脂多糖干预组较未干预组的星形胶质细胞胞体大,突起长。2.传至第3代时,用抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体进行纯度鉴定,结果显示星形胶质细胞纯度可达97%以上,并用ephrinA3多克隆抗体鉴定星形胶质细胞上的ephrinA3表达,可见阳性表达。3.MTT法测定各组星形胶质细胞的存活率发现：脂多糖(10mg/L)作用于星形胶质细胞6h、24h、48h和72h的细胞存活率均提高,与对照组相比均有显著性差异(P<0.05),而30min组细胞存活率与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。30min组、48h组和72h组的细胞存活率与24h组相比均有显著性差(P<0.05)。4. AO/EB荧光染色检测各组星形胶质细胞的凋亡率发现：脂多糖(10mg/L)作用星形胶质细胞6h、24h、48h和72h的细胞凋亡率均下降,与对照组相比均有显著性差异(P<0.05),而30min组细胞存活率与对照组相比无显著性差异30min组、48h组和72h组的细胞凋亡率与24h组相比均有显著性差(P<0.05)。5. CY3荧光染色分别测定各组星形胶质细胞上GFAP和ephrinA3的表达发现：荧光显微镜下观察发现,各组星形胶质细胞的胞体和突起均呈红色荧光,细胞核不显色,为一暗区。脂多糖作用24h、48h和72h的胞体和突起的GFAP和ephrinA3荧光强度与对照组相比有显著增强(P<0.05),而干预30min组和6h组与对照组相比变化不大(P>0.05),各组与24h相比,差异有显著性(P<0.05)。6. ELISA法检测各组星形胶质细胞培养液中TNF-α和IL-6的含量发现：脂多糖作用6h内,IL-6和TNF-α含量维持在低水平,稍有增加(P>0.05),24h时增加明显。与对照组相比,脂多糖作用24h、48h和72h的IL-6和TNF-α含量显著升高(P<0.05)组,与24h组相比,30min组、48h组和72h组的差异有显著性(P<0.05)。结论1.脂多糖(10mg/L)可以促进星形胶质细胞增殖,且至少持续至72h。2. ephrinA3在脂多糖诱导星形胶质细胞增殖过程中表达增高,其机制可能与炎症因子有关。