论文部分内容阅读
在炎症反应期间,血流中的白细胞被血管内皮细胞捕获,稳定粘附后的白细胞会活化,极化变形,最后迁移到受损部位。其中,白细胞的活化过程会伴随着细胞质钙离子浓度升高,对这一信号事件的研究一直都是热门话题。因此,我们需要研究白细胞钙信号。为了真实地模拟生理条件下血流环境,我们采用平板流动腔结合荧光显微镜的实验方法,借助钙离子荧光染料Fluo 4-AM,在流体环境下实时观察E-选择素介导的中性粒细胞稳定粘附后的钙响应,从而对正常生理条件下白细胞活化过程有一个深入的认识。我们将加载了Fluo 4-AM的细胞液以不同的流体剪应力(0~0.6 Pa)灌注到铺有10μg/m L E-选择素的底板上,通过流动腔系统实时观察中性粒细胞黏附及随后产生的钙响应。我们发现,在流场环境下E-选择素可特异性介导中性粒细胞的稳定粘附和钙响应,细胞的黏附数和激活比率随浓度的提高而逐渐增加。只有固定的E-选择素才能传递力信号来有效触发细胞的钙响应,剪应力的增加不仅提高了细胞的激活比率(从23%增至70%),增加了钙响应的强度(从0.92增至1.45),而且大大缩短了细胞自黏附到钙响应启动的时间(从70 s减为27 s)。剪应力和E-选择素协同调控中性粒细胞的钙响应,前者对钙响应的速度和水平实行正向调节。然后,我们用抗体阻断了中性粒细胞上部分配体,研究流场环境下单独的PSGL-1与E-选择素作用诱导白细胞的钙响应。随着流体剪切力的提高,粘附细胞的活化率由0.02 Pa的28%左右逐渐提高到0.6 Pa的73%左右,钙响应的峰值强度由0.02 Pa的0.69提高到0.6 Pa时的1.43左右,延迟时间由0.02 Pa的91 s左右缩短到0.6 Pa时的28 s左右。对比加入阻断剂与未添加阻断剂时E-选择素介导的中性粒细胞钙响应,两者活化率和钙响应峰值强度结果类似,但延迟时间这一特征参数存在差异。在低流体剪应力下(小于0.06 Pa),阻断CD44或同时阻断CD44和L-选择素会影响中性粒细胞发生钙响应的延迟时间;随着流体剪应力的增加,这种影响逐渐减弱;当剪应力增加到0.2 Pa或以上时,添加阻断剂对E-选择素介导的中性粒细胞钙响应没有影响。该研究可深化血流环境下白细胞免疫响应过程的理解。