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研究背景急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是儿童时期最常见的血液系统恶性肿瘤,其永生化的恶性增殖和侵袭程度直接与患儿的预后密切相关。化疗是目前最主要的治疗手段,规范的联合化疗使ALL患儿的5年无事件生存率达到了80%,然而,部分患儿对化疗药物耐药,部分患儿接受了过高强度的化疗。因此,目前儿童ALL治疗研究的热点是改善和修订儿童ALL的预后评估系统,争取实施基于危险因素分组的个体化治疗,包括基因治疗。研究ALL细胞恶性增殖、凋亡及其迁移侵袭的分子机理,不仅为深入了解ALL的发生机制提供新的内涵,更可为寻求新的ALL患儿个体化治疗策略提供具有应用前景的分子靶点。DJ-1基因是一种线粒体依赖癌基因,与多种恶性肿瘤的发生、进展及预后等密切相关。DJ-1在ALL肿瘤细胞恶性增殖、凋亡及其迁移侵袭的过程中可能扮演着重要角色,已经受到广泛关注。DJ-1的表达及作用机制尚未明确,还有待深入研究,如DJ-1的具体信号通路、调控机制等。研究发现DJ-1是10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因(Phosphatase and tensin homology deleted on chromosome10, PTN)的负性调控因子,两者都参与了细胞的凋亡、分化和迁移。我们猜想,DJ-1是否可能通过抑制PTEN的表达而参与调节ALL的恶性增殖、凋亡及其迁移侵袭的过程?本课题通过研究两者在体外培养的ALL细胞中的相互作用,分析DJ-1与ALL的恶性增殖、凋亡及其迁移侵袭的相关性,为进一步阐明ALL发病的分子调控机制提供新的思考方向,为ALL的基因治疗提供新的靶第一部分DJ-1在Jurkat细胞株及ALL患儿骨髓单个核细胞中的表达目的检测DJ-1在人急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat与ALL患儿骨髓单个核细胞(BMMNC)中的表达水平,为进一步探讨是否可以通过靶向作用DJ-1而干预ALL肿瘤细胞的增殖、凋亡等恶性生物学行为奠定实验基础。方法研究对象为人急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat和ALL患儿骨髓单个核细胞BMMNC,免疫性血小板减少症患儿骨髓单个核细胞做对照。体外培养Jurkat细胞；采集符合入选标准的两组患儿的1-1.5mL新鲜骨髓标本,采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离采集的新鲜骨髓标本,提取BMMNC.采用RT-PCR、Western blot检测两种细胞中DJ-1、PTEN的mRN表达水平和蛋白质含量结果应用Western blot检测,与对照组比较,DJ-1在Jurkat细胞和ALL患儿BMMNC中的蛋白表达量均明显上调,PTEN在Jurkat细胞和ALL患儿BMMNC中的蛋白表达量均明显下调,差异均具有显著统计学意义(P<0.01)。应用RT-PCR检测,Jurkat细胞及ALL患儿BMMNC细胞中DJ-1的mRNA表达均明显上调,与对照组相比,差异均具有显著差异(P<0.01)。Jurkat细胞及ALL患儿BMMNC细胞中PTEN的mRNA表达均明显下调,与对照组相比,差异均具有显著差异(P<0.01)。结论DJ-1有可能通过抑制肿瘤抑癌基因PTEN表达及调控PI3K/Akt信号通路而影响ALL肿瘤细胞的生物学活性,可能成为ALL基因治疗的新靶点。第二部分DJ-1对急性淋巴细胞白血病肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响目的探讨DJ-1是否通过下调PTEN表达和提高FAK的磷酸化水平而促进ALL细胞的迁移侵袭,探索ALL基因治疗的新靶点。方法1.以Jurkat细胞作为实验细胞。体外培养获取人ALL细胞株Jurkat,根据人DJ-1mRNA编码序列,设计并构建了DJ-1表达载体。采用pEGFP/DJ-1转染Jurkat细胞后,通过Western blot检测转染后Jurkat细胞中DJ-1、PTEN、FAK、 p-FAK的水平变化,通过Transwell法检测转染前后Jurkat细胞的迁移和侵袭力。2.采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离采集的ALL患儿新鲜骨髓标本,提取BMMNC,以原代细胞作为实验细胞。根据人DJ-1mRNA编码序列,设计并构建了DJ-1的小分子干扰RNA。采用si DJ-1转染ALL患儿BMMNC后,通过Western blot检测细胞中DJ-1、PTEN、FAK、p-FAK的水平变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化；Transwell法检测转染前后细胞的迁移和侵袭力。结果1.DJ-1下调PTEN抑制人Jurkat细胞迁移侵袭的机制研究Jurkat细胞经pEGFP/DJ-1转染48h后,转染pEGFP/DJ-1组DJ-1蛋白和p-FAK蛋白的表达明显强过空白对照组和转染pEGFP-C2空质粒对照组(P<0.05),而PTEN蛋白的表达明显下降,弱于空白对照组和转染pEGFP-C2空质粒对照组(P<0.05)。总FAK的蛋白在各组间表达的差异无显著性(P>0.05)。细胞迁移和侵袭实验中,pEGFP/DJ-1转染48h后,转染pEGFP/DJ-1组迁移穿膜细胞数和侵袭穿膜细胞数均明显增加,与空白对照组和转染pEGFP-C2空质粒对照组比较,有显著的差异(P<0.05)。2. siRNA沉默DJ-1基因对ALL患儿BMMNC迁移侵袭的影响ALL患儿BMMNC经DJ-1siRNA转染后,转染DJ-1siRNA组DJ-1蛋白和p-FK蛋白的表达明显减弱,弱过空白对照组和转染非特异性对照组(P<0.05),而PTEN蛋白的表达明显增强,强于空白对照组和转染非特异性对照组(P<0.05)。总FAK的蛋白在各组间表达的差异无显著性(P>0.05)。ALL患儿BMMNC经DJ-1siRNA转染后,转染DJ-1siRNA组细胞凋亡率明显高于空白对照组和转染非特异性对照组(P<0.05)。空白对照组和转染非特异性对照组比较,细胞凋亡率均无明显差异(P>0.05)。细胞迁移和侵袭实验中,DJ-1siRNA转染后,转染DJ-1siRNA组迁移穿膜细胞数和侵袭穿膜细胞数均明显减少,与空白对照组和转染非特异性对照组比较,有显著的差异(P<0.05)。而空白对照组和转染非特异性对照组间比较无明显差异(P>0.05)。结论1.DJ-1能促进人ALL细胞株Jurkat的迁移与侵袭,这可能与DJ-1负反馈调节PTEN表达,并间接抑制FAK的去磷酸化有关,DJ-1对PTEN的负调控功能可能是ALL基因治疗研究的新方向。2.小分子干扰RNA下调DJ-1蛋白的表达,能诱导BMMNC的凋亡增加,并抑制了细胞的迁移和侵袭能力,这种作用可能与DJ-1促进PTEN的表达及提高FAK的去磷酸化水平有关。第三部分EGCG下调DJ-1、抑制急性淋巴细胞白血病肿瘤细胞迁移侵袭的研究目的1.研究EGCG对Jurkat细胞和ALL患儿BMMNC迁移侵袭的抑制作用及其机制。2.探讨EGCG是否可能是通过靶向抑制DJ-1来逆转ALL细胞增殖、诱导其凋亡及抑制ALL肿瘤细胞迁移侵袭的恶性生物学行为。方法以Jurkat细胞和ALL患儿BMMNC作为实验细胞,给予不同浓度的EGCG处理,通过MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化,通过Transwell法检测Jurkat细胞和ALL患儿BMMNC的迁移和侵袭力。同时应用pEGFP/DJ-1阻断EGCG作用,通过Transwell实验观察EGCG是否能通过下调DJ-1的表达来抑制ALL肿瘤细胞的迁移侵袭。结果经不同浓度EGCG处理不同时间后,Jurkat细胞、ALL患儿BMMNC的增殖均受到不同程度的抑制。各EGCG处理组的抑制率均明显高于对照组(P<0.05),且10、25、50、80、100μ mol/L EGCG作用随着其浓度的增加和作用时间的延长,细胞抑制率逐渐增高,呈剂量和时间依赖关系,经不同浓度EGCG处理不同时间后,不同程度地诱导Jurkat细胞、ALL患儿BMMNC的凋亡。各EGCG处理组的凋亡率均明显高于对照组(P<0.05),且10、25、50、80、100μ mol/LEGCG作用随着其浓度的增加和作用时间的延长,细胞凋亡率逐渐增高,呈剂量和时间依赖关系。细胞迁移和侵袭实验中,Jurkat细胞、ALL患儿BMMNC经不同浓度EGCG预处理12、24、48h后,细胞的迁移穿膜细胞数和侵袭穿膜细胞数均明显减少,与对照组比较,有显著的差异(P<0.05),且呈现剂量和时间依赖性。Jurkat细胞、ALL患儿BMMNC经pEGFP/DJ-1,EGCG,pEGFP/DJ-1+EGCG预处理48h后,细胞的迁移穿膜细胞数和侵袭穿膜细胞数发生不同变化,与对照组相比,100μmol/L EGCG单独处理24h后,Jurkat细胞的迁移穿膜细胞数和侵袭穿膜细胞数均明显减少,单独转染pEGFP/DJ-1的细胞的迁移穿膜细胞数和侵袭穿膜细胞数均明显增多。经过转染pEGFP/DJ-124h后再加入EGCG处理24h后,迁移和侵袭的细胞均比单独使用EGCG组增多,但少于单独转染pEGFP/DJ-1组。即EGCG抑制迁移侵袭的效果受到了pEGFP/DJ-1转染的影响。结论DJ-1有可能是EGCG的靶基因,EGCG可能通过下调DJ-1表达而抑制ALL肿瘤细胞迁移和侵袭。